Analyse semi-quantitative du peptidoglycane par chromatographie liquide Spectrométrie de masse et bioinformatique

Le peptidoglycane (PG) est une caractéristique déterminante des bactéries qui sert à maintenir la morphologie cellulaire, tout en fournissant un soutien structurel aux protéines et autres composants cellulaires ^1,2. L’épine dorsale du PG est composée d’acide muramique N-acétyl lié au β-1,4-1,4 (MurNAc) et de N-acétyl glucosamine (GlcNAc)^1,2. Chaque MurNAc possède un peptide court lié au résidu ᴅ-lactyle qui peut être réticulé avec des peptides adjacents liés au disaccharide (Figure 1A,B). Cette réticulation produit une structure en forme de maille qui englobe toute la cellule et est souvent appelée sacculus (Figure 1C). Au cours de la synthèse du PG, des précurseurs sont générés dans le cytoplasme et transportés à travers la membrane cytoplasmique par des flippases. Les précurseurs sont ensuite incorporés dans le PG mature par les enzymes transglycosylase et transpeptidase, qui produisent respectivement^les liaisons glycosidique et peptidique3. Cependant, une fois assemblées, il existe de nombreuses enzymes produites par les bactéries qui modifient et / ou dégradent le PG pour effectuer un certain nombre de processus cellulaires, y compris la croissance et la division. En outre, il a été démontré que diverses modifications du PG confèrent des adaptations spécifiques à la souche, aux conditions de croissance et au stress environnemental, qui ont été impliquées dans la signalisation cellulaire, la résistance aux antimicrobiens et l’évasion immunitaire de l’hôte⁴. À titre d’exemple, une modification courante est l’ajout d’un groupe acétyle C6 sur le MurNAc qui confère une résistance en limitant l’accès aux liaisons glycane β-1,4 aux enzymes lysozymes produites par l’hôte qui dégradent PG ^4,5,6. Chez les entérocoques, la substitution du ᴅ-Ala terminal de la chaîne latérale peptidique par ᴅ-Lac confère une plus grande résistance à l’antimicrobien, la vancomycine ^7,8.

La procédure générale d’isolement et de purification des PG est restée relativement inchangée depuis qu’elle a été décrite dans les années 1960⁹. Les membranes bactériennes sont dissoutes par traitement thermique avec SDS, suivi de l’élimination enzymatique des protéines liées, des glycolipides et de l’ADN restant. Le sacculus intact purifié peut ensuite être digéré en composants individuels par hydrolyse de la liaison β-1,4 entre GlcNAc et MurNAc. Cette digestion produit des disaccharides GlcNAc-MurNAc avec toutes les modifications structurelles et / ou réticulations intactes et sont appelés muropeptides (Figure 1B).

L’analyse de la composition du PG a d’abord été réalisée par séparation chromatographique liquide à haute pression (CLHP) pour purifier chaque muropeptide, suivie d’une identification manuelle des muropeptides^10,11. Cela a depuis été remplacé par la spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS), qui augmente la sensibilité de détection et diminue la charge de travail manuelle de purification de chaque muropeptide individuel. Cependant, la nature longue et complexe de l’identification manuelle des muropeptides est restée un facteur limitant, réduisant le nombre d’études menées. Ces dernières années, avec l’émergence des technologies « omiques », l’extraction automatisée de caractéristiques LC-MS est devenue un outil puissant, permettant la détection et l’identification rapides de composés individuels dans des échantillons complexes à partir de très grands ensembles de données. Une fois les caractéristiques identifiées, le logiciel bioinformatique compare statistiquement la variation entre les échantillons à l’aide d’une analyse différentielle isolant même les différences minimes entre les ensembles de données complexes et les affichant graphiquement à l’utilisateur. L’application de logiciels d’extraction de caractéristiques pour l’analyse de la composition PG vient tout juste de commencer à être explorée 12,13,14 et couplée à l’analyse bioinformatique ¹². Contrairement à l’analyse protéomique qui bénéficie des bases de données de protéines facilement disponibles qui prédisent la fragmentation peptidique permettant une identification entièrement automatisée, il n’existe actuellement aucune bibliothèque de fragmentation pour la peptidoglycomie. Cependant, l’extraction de caractéristiques peut être couplée à des bases de données structurelles connues et prévues pour prédire l’identification des muropeptides¹². Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’utilisation de l’extraction de caractéristiques à base de LC-MS combinée à une bibliothèque de muropeptides pour l’identification automatisée et l’analyse différentielle bioinformatique de la composition PG (Figure 2).