Semi-kwantitatieve analyse van peptidoglycaan door vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en bio-informatica

Peptidoglycan (PG) is een bepalend kenmerk van bacteriën dat dient om de celmorfologie te behouden, terwijl het structurele ondersteuning biedt voor eiwitten en andere cellulaire componenten ^1,2. De ruggengraat van PG bestaat uit afwisselend β-1,4-gebonden N-acetyl muramic acid (MurNAc) en N-acetyl glucosamine (GlcNAc)^1,2. Elke MurNAc bezit een kort peptide gebonden aan het ᴅ-lactylresidu dat kan worden gekruist met aangrenzende disacharide-gekoppelde peptiden (figuur 1A,B). Deze crosslinking produceert een mesh-achtige structuur die de hele cel omvat en vaak een sacculus wordt genoemd (figuur 1C). Tijdens PG-synthese worden voorlopers gegenereerd in het cytoplasma en door flippasen over het cytoplasmamembraan getransporteerd. Voorlopers worden vervolgens opgenomen in de volwassen PG door transglycosylase en transpeptidase-enzymen, die respectievelijk de glycosidische en peptidebindingen produceren³. Eenmaal geassembleerd, zijn er echter tal van enzymen geproduceerd door de bacteriën die de PG wijzigen en / of afbreken om een aantal cellulaire processen uit te voeren, waaronder groei en deling. Bovendien is aangetoond dat verschillende modificaties van de PG aanpassingen geven die specifiek zijn voor de stam, groeiomstandigheden en omgevingsstress, die betrokken zijn bij celsignalering, antimicrobiële resistentie en immuunontwijking van de gastheer⁴. Een veel voorkomende modificatie is bijvoorbeeld de toevoeging van een C6-acetylgroep op de MurNAc die resistentie verleent door de toegang tot de glycaan-β-1,4-bindingen te beperken tot door de gastheer geproduceerde lysozymenzymen die PG ^4,5,6 afbreken. Bij Enterokokken verleent substitutie van de terminale ᴅ-Ala van de peptide-sidechain door ᴅ-Lac een grotere resistentie tegen de antimicrobiële vancomycine ^7,8.

De algemene procedure voor PG-isolatie en -zuivering is relatief ongewijzigd gebleven sinds deze in de jaren 1960 werd beschreven⁹. Bacteriële membranen worden opgelost door warmtebehandeling met SDS, gevolgd door enzymatische verwijdering van gebonden eiwitten, glycolipiden en overblijvend DNA. De gezuiverde intacte sacculus kan vervolgens worden verteerd tot de afzonderlijke componenten door hydrolyse van de β-1,4 koppeling tussen GlcNAc en MurNAc. Deze vertering produceert GlcNAc-MurNAc-disachariden met intacte structurele wijzigingen en/of crosslinks en worden muropeptiden genoemd (figuur 1B).

Compositieanalyse van PG werd aanvankelijk uitgevoerd door middel van hogedrukvloeistofchromatografische scheiding (HPLC) om elk muropeptide te zuiveren, gevolgd door handmatige identificatie van muropeptiden^10,11. Dit is sindsdien vervangen door vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS), die de detectiegevoeligheid verhoogt en de handmatige werklast van het zuiveren van elk individueel muropeptide vermindert. De tijdrovende en complexe aard van de handmatige identificatie van muropeptiden is echter een beperkende factor gebleven, waardoor het aantal uitgevoerde studies is afgenomen. In de afgelopen jaren met de opkomst van “omic” -technologieën, is geautomatiseerde LC-MS-functie-extractie een krachtig hulpmiddel geworden, waardoor snelle detectie en identificatie van individuele verbindingen in complexe monsters uit zeer grote datasets mogelijk is. Zodra de kenmerken zijn geïdentificeerd, vergelijkt bioinformatische software statistisch de variatie tussen monsters met behulp van differentiële analyse, waarbij zelfs minimale verschillen tussen de complexe dataset worden geïsoleerd en grafisch aan de gebruiker worden weergegeven. De toepassing van feature extraction software voor de analyse van PG samenstelling is nog maar net begonnen te worden onderzocht 12,13,14 en gekoppeld aan bioinformatica analyse ¹². In tegenstelling tot proteomische analyse, die profiteert van de direct beschikbare eiwitdatabases die peptidefragmentatie voorspellen, waardoor volledig geautomatiseerde identificatie mogelijk is, bestaat er momenteel geen fragmentatiebibliotheek voor peptidoglycomics. Functie-extractie kan echter worden gekoppeld aan bekende en voorspelde structurele databases om muropeptide-identificatie te voorspellen¹². Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van LC-MS-gebaseerde functie-extractie in combinatie met een muropeptidebibliotheek voor geautomatiseerde identificatie en bioinformatische differentiële analyse van PG-samenstelling (figuur 2).