التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية
Summary
يغطي هذا البروتوكول تحليلا مفصلا لتكوين الببتيدوغليكان باستخدام قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب استخراج الميزات المتقدمة وبرامج تحليل المعلوماتية الحيوية.
Abstract
الببتيدوغليكان هو عنصر مهم في جدران الخلايا البكتيرية وهدف خلوي شائع لمضادات الميكروبات. على الرغم من أن جوانب بنية الببتيدوغليكان محفوظة إلى حد ما في جميع البكتيريا ، إلا أن هناك أيضا تباينا كبيرا بين إيجابيات / سلبيات الجرام وبين الأنواع. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من الاختلافات أو التعديلات أو التكيفات المعروفة على الببتيدوغليكان التي يمكن أن تحدث داخل الأنواع البكتيرية استجابة لمرحلة النمو و / أو المحفزات البيئية. تنتج هذه الاختلافات بنية ديناميكية للغاية معروفة بالمشاركة في العديد من الوظائف الخلوية ، بما في ذلك النمو / الانقسام ، ومقاومة المضادات الحيوية ، وتجنب دفاع المضيف. لفهم التباين داخل الببتيدوغليكان ، يجب تقسيم الهيكل العام إلى أجزائه المكونة (المعروفة باسم muropeptides) وتقييمها للتكوين الخلوي العام. يستخدم Peptidoglycomics قياس الطيف الكتلي المتقدم جنبا إلى جنب مع تحليل بيانات المعلوماتية الحيوية عالية الطاقة لفحص تكوين الببتيدوغليكان بتفاصيل دقيقة. يصف البروتوكول التالي تنقية الببتيدوغليكان من الثقافات البكتيرية ، والحصول على بيانات كثافة الموروببتيد من خلال كروماتوجراف سائل – مطياف الكتلة ، والتحليل التفاضلي لتكوين الببتيدوغليكان باستخدام المعلوماتية الحيوية.
Introduction
الببتيدوغليكان (PG) هو سمة مميزة للبكتيريا تعمل على الحفاظ على مورفولوجيا الخلية ، مع توفير الدعم الهيكلي للبروتينات والمكونات الخلوية الأخرى 1,2. يتكون العمود الفقري ل PG من حمض N-acetyl muramic المرتبط ب β-1،4 (MurNAc) و N-acetyl glucosamine (GlcNAc) 1,2. يمتلك كل MurNAc ببتيدا قصيرا مرتبطا ببقايا ᴅ-lactyl يمكن ربطه بالببتيدات المجاورة المرتبطة بالسكاريد (الشكل 1أ ، ب). ينتج عن هذا التشابك بنية تشبه الشبكة تشمل الخلية بأكملها وغالبا ما يشار إليها باسم الكيس (الشكل 1C). أثناء تخليق PG ، يتم إنشاء السلائف في السيتوبلازم ، ويتم نقلها عبر الغشاء السيتوبلازمي بواسطة الزعانف. يتم دمج السلائف لاحقا في PG الناضج بواسطة إنزيمات transglycosylase و transpeptidase ، والتي تنتج روابط glycosidic والببتيد ، على التوالي3. ومع ذلك ، بمجرد تجميعها ، هناك العديد من الإنزيمات التي تنتجها البكتيريا التي تعدل و / أو تحلل PG لتنفيذ عدد من العمليات الخلوية ، بما في ذلك النمو والانقسام. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن التعديلات المختلفة ل PG تمنح تكيفات خاصة بالسلالة وظروف النمو والإجهاد البيئي ، والتي تورطت في إشارات الخلية ، ومقاومة مضادات الميكروبات ، والتهرب المناعي للمضيف4. على سبيل المثال ، التعديل الشائع هو إضافة مجموعة C6 acetyl على MurNAc التي تمنح المقاومة عن طريق الحد من الوصول إلى روابط الجليكان β-1,4 إلى إنزيمات الليزوزيم المنتجة من المضيف والتي تحلل PG4،5،6. في المكورات المعوية ، يمنح استبدال الطرف ᴅ-Ala من السلسلة الجانبية للببتيد ب ᴅ-Lac مقاومة أكبر لمضادات الميكروبات ، فانكومايسين 7,8.
ظل الإجراء العام لعزل وتنقية PG دون تغيير نسبيا منذ أن تم وصفه في ستينيات القرن العشرين9. يتم إذابة الأغشية البكتيرية من خلال المعالجة الحرارية باستخدام SDS ، تليها الإزالة الأنزيمية للبروتينات المرتبطة ، والجليكوليبيدات ، والحمض النووي المتبقي. يمكن بعد ذلك هضم الكيس السليم المنقى في المكونات الفردية عن طريق التحلل المائي للارتباط β-1،4 بين GlcNAc و MurNAc. ينتج هذا الهضم ثنائي السكاريد GlcNAc-MurNAc مع أي تعديلات هيكلية و / أو روابط متقاطعة سليمة وتسمى muropeptides (الشكل 1B).
تم إجراء التحليل التركيبي ل PG في البداية من خلال الفصل الكروماتوجرافي السائل عالي الضغط (HPLC) لتنقية كل موروببتيد متبوعا بالتحديد اليدوي للببتيدات الموروببتيدات10,11. ومنذ ذلك الحين تم استبدال هذا بقياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS) ، مما يزيد من حساسية الكشف ويقلل من عبء العمل اليدوي لتنقية كل ببتيد موروببتيد فردي. ومع ذلك ، ظلت الطبيعة المعقدة والمستهلكة للوقت للتحديد اليدوي للببتيدات muropeptides عاملا مقيدا ، مما قلل من عدد الدراسات التي أجريت. في السنوات الأخيرة مع ظهور التقنيات “omic” ، أصبح استخراج ميزة LC-MS الآلي أداة قوية ، مما يسمح بالكشف السريع وتحديد المركبات الفردية في عينات معقدة من مجموعات بيانات كبيرة جدا. بمجرد تحديد الميزات ، يقارن برنامج المعلوماتية الحيوية إحصائيا التباين بين العينات باستخدام التحليل التفاضلي لعزل حتى الحد الأدنى من الاختلافات بين مجموعة البيانات المعقدة وعرضها بيانيا للمستخدم. بدأ للتو استكشاف تطبيق برنامج استخراج الميزات لتحليل تكوين PG 12،13،14 ويقترن بتحليل المعلوماتية الحيوية 12. على عكس التحليل البروتيني الذي يستفيد من قواعد بيانات البروتين المتاحة بسهولة والتي تتنبأ بتجزئة الببتيد مما يسمح بتحديد الهوية الآلي بالكامل ، لا توجد مكتبة تجزئة حاليا ل peptidoglycomics. ومع ذلك ، يمكن أن يقترن استخراج المعالم بقواعد بيانات هيكلية معروفة ومتوقعة للتنبؤ بتحديد muropeptide12. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لاستخدام استخراج الميزات المستندة إلى LC-MS جنبا إلى جنب مع مكتبة muropeptide لتحديد الهوية الآلية والتحليل التفاضلي المعلوماتي الحيوي لتكوين PG (الشكل 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة لتنقية الببتيدوغليكان من الثقافات البكتيرية ، وعملية للكشف عن LC-MS وتحليل التركيب باستخدام تقنيات المعلوماتية الحيوية. هنا ، نركز على البكتيريا سالبة الجرام وستكون هناك حاجة إلى بعض التعديلات الطفيفة لتمكين تحليل البكتيريا إيجابية الجرام.
ظل إعدا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة جنيفر جيديس ماك أليستر والدكتور أنتوني كلارك على مساهماتهم في تحسين هذا البروتوكول. تم دعم هذا العمل من خلال المنح التشغيلية المقدمة من مركز القاهرة لحقوق الإنسان الممنوحة ل C.M.K (PJT 156111) و NSERC Alexander Graham Bell CGS D الممنوحة ل EMA تم إنشاء الأرقام في BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| C18 reverse phase column – AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) | Agilent | LC-MS data acquisition | |
| Heating mantle controller, Optichem | Fisher | 50-401-788 | for 4% SDS boil |
| Heating Mantle, 1000mL Hemispherical | Fisher | CG1000008 | for 4% SDS boil |
| Incubator, 37°C | for sacculi purification and MS sample prep | ||
| Leibig condenser, 300MM 24/40, | Fisher | CG121805 | for 4% SDS boil |
| Lyophilizer | Labconco | for lyophilization of sacculi | |
| Magentic stirrer | Fisher | 90-691-18 | for 4% SDS boil |
| mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 | Aglient | LC-MS data acquisition | |
| microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm | Fisher | 50-197-9573 | cleanup of sample before MS injection |
| Retort stand | Fisher | 12-000-102 | for 4% SDS boil |
| Retort clamp | Fisher | S02629 | for 4% SDS boil |
| round bottom flask – 1 liter pyrex | Fisher | 07-250-084 | for 4% SDS boil |
| Sonicator model 120 | Fisher | FB120 | for sacculi purification |
| Sonicator – micro tip | Fisher | FB4422 | for sacculi purification |
| Ultracentrifuge | Beckman | sacculi wash steps | |
| Ultracentrifuge bottles, Ti45 | Fisher | NC9691797 | sacculi wash steps |
| Water supply | City | for water cooled condenser | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgesoft | molecular editor for muropeptide fragmentation prediction | |
| Excel | Microsoft | viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc. | |
| MassHunter Acquisition | Aglient | running QTOF instrument | |
| MassHunter Mass Profiler Professional | Aglient | bioinformatic differential analysis | |
| MassHunter Personal Compound Database and Library Manager | Aglient | muropeptide m/z MS database | |
| MassHunter Profinder | Aglient | recursive feature extraction | |
| MassHunter Qualitative analysis | Aglient | viewing MS and MS/MS chromatograms | |
| Prism | Graphpad | Graphing software | |
| Perseus | Max Plank Institute of Biochemistry | 1D annotation | |
| Material | |||
| Acetonitrile | Fisher | A998-4 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637 | |
| Amylase | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Boric acid | Fisher | BP168-1 | |
| DNase | Fisher | EN0521 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| LC-MS tuning mix – HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Nitrogen gas (>99% purity) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Phosphoric acid | Fisher | A242 | |
| Pronase E from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNase | Fisher | EN0531 | |
| Sodium azide | Fisher | S0489 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318 | |
| Sodium Phosphate (dibasic) | Fisher | S373 | |
| Sodium Phosphate (monobasic) | Fisher | S369 | |
| Stains-all | Sigma-Aldrich | E9379 |
References
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
- Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
- Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
- Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
- Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
- Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
- Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
- Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
- Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
- Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
- van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
- Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
- Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
- Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
- Rusconi, F., Douard Valton, &. #. 2. 0. 1. ;., Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
- Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
- Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, 12 (2012).
- Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
- Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
- Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
- Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
- Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
- Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
- Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
- De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
- Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie – International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
- Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
- Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).
