T و B الخلية مستقبلات المناعة مرجع التحليل باستخدام الجيل القادم التسلسل
Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة لعزل الحمض النووي من عينات الدم والخزعات المعوية ، وتوليد مكتبات TCRβ و IGH PCR لتسلسل الجيل التالي ، وأداء تشغيل NGS وتحليل البيانات الأساسية.
Abstract
الذاكرة المناعية، السمة المميزة للمناعة التكيفية، يتم تنظيمها من قبل الخلايا الليمفاوية T و B. في الدورة الدموية والأعضاء المختلفة ، وهناك مليارات من استنساخ الخلايا الفريدة تي وباء ، ويمكن لكل واحد ربط مستضد معين ، مما يؤدي إلى الانتشار والتمايز و / أو إفراز السيتوكين. يتم إنشاء التغايرية واسعة في الخلايا T و B عن طريق إعادة دمج عشوائي من شرائح وراثية مختلفة. تمكن تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) ، التي تم تطويرها في العقد الماضي ، من رؤية متعمقة غير مسبوقة للذخيرة المناعية لمستقبلات الخلايا T و B. أظهرت الدراسات في مختلف الحالات الالتهابية والفيزيولوجيا المناعية والعدوى والخبيثة تغيرات ملحوظة في اللاستنساخ واستخدام الجينات والخصائص الفيزيائية الحيوية للذخيرة المناعية ، مما يوفر رؤى مهمة حول دور الاستجابات المناعية التكيفية في الاضطرابات المختلفة.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لNGS من ذخيرة المناعة من الخلايا T و B من الدم والأنسجة. نحن نقدم خط أنابيب بدءا من عزل الحمض النووي من خلال إعداد المكتبة ، والتسلسل على المنظم NGS وتنتهي مع التحليلات الأساسية. تمكن هذه الطريقة من استكشاف خلايا T و B محددة على مستوى النيوكليوتيدات أو الأحماض الأمينية ، وبالتالي يمكن تحديد التغيرات الديناميكية في مجموعات الخلايا الليمفاوية ومعلمات التنوع في الأمراض المختلفة. هذه التقنية تدخل ببطء الممارسة السريرية ولديها القدرة على تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة ، وتقسيم المخاطر والطب الدقيق.
Introduction
يستخدم الجهاز المناعي التكيفي، المكون من الخلايا اللمفاوية T و B، الذاكرة المناعية للتعرف على مستضد سبق مواجهته وبدء استجابة سريعة. يتم إنشاء الخلايا الليمفاوية في نخاع العظام وتنضج في الغدة الصعترية (الخلايا التائية) أو نخاع العظم (خلايا B). تعرض كل من مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ومستقبلات الخلايا B (BCR) تكوينات فريدة تسمح بالاعتراف بالمضادات المحددة. في التوازن، T و B الخلايا تعميم ومسح باستمرار تريليونات الببتيدات المختلفة المقدمة على الخلايا تقديم مستضد. ربط TCR أو BCR مستضد معين مع تقارب عالية، جنبا إلى جنب مع التحفيز المشترك المناسب، يؤدي إلى تنشيط الخلية، مما أدى إلى إفراز السيتوكين، والتوسع اللاستنساخي وتوليد الأجسام المضادة، في حالة الخلايا B.
تسمى المجموعة الهائلة من الخلايا T أو B المختلفة ذخيرة المناعة بشكل جماعي ، مما يتيح التعرف على عدد لا يحصى من الأسطح المختلفة. من أجل توليد مثل هذه ذخيرة واسعة، عملية معقدة من التجمع العشوائي من شرائح الجينات المختلفة يحدث، وخلق مجموعات لا نهاية لها تقريبا من المستقبلات التي يمكن أن تربط مستضدات فريدة من نوعها1. هذه العملية، ودعا V (D)J إعادة التركيب، ويشمل إعادة ترتيب متغير مختلف (V)، والتنوع (D) والانضمام (J) الجينات، يرافقه حذف عشوائي وإدراج النيوكليوتيدات فيتقاطعات 2.
وقد أثارت بنية الجهاز المناعي التكيفي اهتمام العلماء في مجالات مختلفة لعقود عديدة. في الماضي، كان تسلسل سانجر، والتحديد التكميلي للمنطقة 3 (CDR3) الأطياف، وقياس التدفق الخلوي تستخدم لتوصيف ذخيرة المناعة، ولكن قدمت دقة منخفضة. في العقد الماضي، مكن التقدم في الجيل القادم من أساليب التسلسل (NGS) من رؤية متعمقة لخصائص وتكوين ذخيرتي TCR و BCRللفرد 3و4. هذه النظم عالية الإنتاجية (HTS) تسلسل ومعالجة الملايين من المنتجات TCR أو BCR إعادة ترتيبها في وقت واحد، وتسمح بتحليل عالية الدقة من خلايا T و B محددة على مستوى النيوكليوتيد أو الأحماض الأمينية. NGS يوفر استراتيجية جديدة لدراسة ذخيرة المناعة في كل من الصحة والمرض. أظهرت الدراسات التي تستخدم HTS تغيير TCR وBCR repertoires في أمراض المناعة الذاتية5، وdeficiencies المناعية الأولية6،7، والأورام الخبيثة ، كما هو الحال في سرطان الدم النخاعي الحاد8. باستخدام NGS ، أظهرنا نحن وآخرون توسعا في قلة القلة لاستنساخ خلايا T و B محددة ، في المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء (IBD) ، بما في ذلك التهاب القولون التقرحيومرض كرون9و10و11و12و13و14. بشكل عام، تشير الدراسات من مختلف المجالات إلى أن التغيرات في الذخيرة لها دور حاسم في مسببات الأمراض في الاضطرابات بوساطة المناعة.
يصف البروتوكول الحالي طريقة لعزل الحمض النووي عن الخزعات المعوية والدم ، وتوليد مكتبات TCRβ و IGH PCR ل NGS ، وأداء تشغيل التسلسل. كما نقدم الخطوات الأساسية في تحليل بيانات الذخيرة المناعية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على إنشاء مكتبات TCRα و TCRа و IGL أيضا. كما تتوافق هذه الطريقة مع الأعضاء الأخرى (مثل الغدد الليمفاوية والأورام والسائل الزليلي والأنسجة الدهنية وما إلى ذلك) طالما يتم استخدام بروتوكولات الهضم الخاصة بالأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وغالبا ما تواجه التغيرات في وفرة ووظيفة الخلايا الليمفاوية B و T في الأورام الخبيثة المختلفة18, اضطرابات التهابية مزمنة (على سبيل المثال, التهاب القولون التقرحي والتهاب المفاصل الروماتويدي)10,19, وفي مختلف المناعي17,20</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn’s Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn’s disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn’s and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn’s disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
