Isolamento e analisi delle lipoproteine plasmatiche mediante ultracentrifugazione
Summary
Diversi metodi sono stati utilizzati per analizzare le lipoproteine plasmatiche; tuttavia, l’ultracentrifugazione è ancora uno dei metodi più popolari e affidabili. Qui descriviamo un metodo su come isolare le lipoproteine dal plasma usando l’ultracentrifugazione a densità sequenziale e come analizzare le apolipoproteine sia a scopo diagnostico che di ricerca.
Abstract
L’analisi delle lipoproteine plasmatiche e delle apolipoproteine è una parte essenziale per la diagnosi di dislipidemia e gli studi sul metabolismo lipidico e sull’aterosclerosi. Sebbene esistano diversi metodi per analizzare le lipoproteine plasmatiche, l’ultracentrifugazione è ancora uno dei metodi più popolari e affidabili. A causa della sua procedura di separazione intatta, le frazioni di lipoproteina isolate con questo metodo possono essere utilizzate per l’analisi di lipoproteine, apolipoproteine, proteomi e studio funzionale delle lipoproteine con cellule coltivate in vitro. Qui forniamo un protocollo dettagliato per isolare sette frazioni di lipoproteina tra cui VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDL (d=1,08, 1,10 e 1,21 g/mL) dal plasma di coniglio utilizzando ultracentrifugazione galleggiante sequenziale. Inoltre, introduciamo ai lettori come analizzare le apolipoproteine come apoA-I, apoB e apoE di SDS-PAGE e Western blotting e mostriamo risultati rappresentativi dei profili di lipoproteina e apolipoproteina utilizzando modelli di coniglio iperlipidemico. Questo metodo può diventare un protocollo standard sia per i medici che per gli scienziati di base per analizzare le funzioni della lipoproteina.
Introduction
La dislipidemia è il principale fattore di rischio della malattia aterosclerotica nel mondo. Alti livelli di lipoproteine a bassa densità (LDL) e bassi livelli di lipoproteine ad alta densità (HDL) sono strettamente associati ad un alto rischio di malattie coronarica (CHD)1,2. Nell’ambiente clinico, sia il colesterolo LDL (LDL-C) che il colesterolo HDL (HDL-C) vengono misurati regolarmente utilizzando un analizzatore automatizzato in un laboratorioclinico 3,4. Nonostante ciò, è essenziale analizzare i profili di lipoproteina nei dettagli per la diagnosi di dislipidemia e lo studio del metabolismo lipidico e dell’aterosclerosi negli animali umani e sperimentali. Diversi metodi sono stati segnalati per analizzare le lipoproteine plasmatiche come l’ultracentrifugazione, la cromatografia ad esclusione delle dimensioni [cromatografia liquida proteica veloce (FPLC) e cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)], l’elettroforesi da gel di agarosio e poliacrilammide, risonanza magnetica nucleare e precipitazioni chimiche selettive usando polianioni e formazioni divalenti o altre sostanze chimiche. Negli anni ’50, il gruppo di Havel propose per la prima volta il concetto di lipoproteine definite dalle densità usando l’ultracentrifugazione e le classificò in chilomicroni (CM), lipoproteine a bassissimo densità (VLDL), lipoproteine a densità intermedia (IDL), LDL e HDL5 e successivamente, il metodo fu ulteriormente modificato da altrigruppi 6,7. Fino ad ora, l’ultracentrifugazione è il metodo più popolare e affidabile mentre il protocollo pratico non è ancora disponibile. In questo documento, abbiamo cercato di descrivere un protocollo facile da usare per isolare una piccola scala di plasma usando l’ultracentrifugazione galleggiante a densità sequenziale originariamente descrittain precedenza 8. Isolamento di sette frazioni plasmatiche lipoproteine [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDL (d=1,08, 1.10, e 1.21 g/mL)] consente ai ricercatori di effettuare un'analisi approfondita sia delle lipoproteine che delle loro apolipoproteine compositive9,10,11. Le lipoproteine intatte a sette densità consecutive possono essere utilizzate per analizzare le funzioni della lipoproteina e servire anche a strategie in vitro basate su cellule. Questo protocollo dovrebbe essere utile sia per la diagnosi clinica che per la ricerca di base. Qui abbiamo usato il plasma di coniglio come esempio per dimostrare questa tecnica mentre il plasma di altre specie può essere applicato allo stesso modo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’iperlipidemia è uno dei principali fattori di rischio della malattia aterosclerotica. Pertanto, l’analisi delle lipoproteine plasmatiche non è solo essenziale per la diagnosi di pazienti con dislipidemia, ma anche importante per lo studio dei meccanismi molecolari del metabolismo della lipoproteina e dell’aterosclerosi. In questo studio, abbiamo descritto il protocollo di isolamento e analisi delle lipoproteine plasmatiche che può essere applicato nei laboratori in cui è disponibile l’ultracentrifugazione. Le infor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di ricerca del JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, della National Natural Science Foundation of China (n. 81941001 e 81770457), JSPS-CAS nell’ambito del Japan-China Research Cooperative Program.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
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