בידוד וניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה על ידי Ultracentrifugation
Summary
מספר שיטות שימשו לניתוח ליפופרוטאינים פלזמה; עם זאת, ultracentrifugation היא עדיין אחת השיטות הפופולריות והאמינים ביותר. כאן, אנו מתארים שיטה לגבי איך לבודד ליפופרוטאינים מפלזמה באמצעות ultracentrifugation צפיפות רציפה וכיצד לנתח את apolipoproteins הן למטרות אבחון ומחקר.
Abstract
ניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה ו apolipoproteins הוא חלק חיוני לאבחון של דיסליפידמיה ומחקרים של חילוף החומרים של השומנים וטרשת עורקים. אמנם ישנן מספר שיטות לניתוח ליפופרוטאינים פלזמה, ultracentrifugation היא עדיין אחת השיטות הפופולריות והאמינות ביותר. בגלל הליך ההפרדה שלם שלה, שברי ליפופרוטאין מבודד בשיטה זו ניתן להשתמש לניתוח של ליפופרוטאינים, apolipoproteins, פרוטאומים, ומחקר פונקציונלי של ליפופרוטאינים עם תאים מתורבתים במבחנה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שבעה שברי ליפופרוטאין כולל VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d = 1.02 g / mL), LDLs (d = 1.04 ו 1.06 g / mL), HDLs (d = 1.08, 1.10, ו 1.21 g/mL) מפלזמת ארנב באמצעות ultracentrifugation צף רציף. בנוסף, אנו מציגים לקוראים כיצד לנתח אפוליפופרוטאינים כגון apoA-I, apoB, ו apoE על ידי SDS-PAGE ו blotting המערבי ולהראות תוצאות מייצגות של פרופילי ליפופרוטאין ו apolipoprotein באמצעות מודלים ארנב היפרליפידמי. שיטה זו יכולה להפוך לפרוטוקול סטנדרטי הן עבור רופאים והן עבור מדענים בסיסיים כדי לנתח פונקציות ליפופרוטאין.
Introduction
דיסליפידמיה היא גורם הסיכון העיקרי של מחלה טרשת עורקים בעולם. רמות גבוהות של ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (LDLs) ורמות נמוכות של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה (HDLs) קשורים קשר הדוק עם סיכון גבוה למחלות לב כלילית (CHD)1,2. בסביבה הקלינית, הן LDL-כולסטרול (LDL-C) והן HDL-כולסטרול (HDL-C) נמדדים באופן שגרתי באמצעות מנתח אוטומטי במעבדה קלינית3,4. למרות זאת, חיוני לנתח פרופילי ליפופרוטאין בפרטים לאבחון דיסליפידמיה וחקר חילוף החומרים של השומנים וטרשת עורקים בבעלי חיים אנושיים וניסיוניים. דווח על מספר שיטות לניתוח ליפופרוטאינים מפלזמה כגון אולטרה-צנטריפוגציה, כרומטוגרפיה של הדרת גודל [כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה (FPLC) וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)], אלקטרופורזה על ידי ג’לים אגרוז ופוליאקרילמיד, תהודה מגנטית גרעינית ומשקעים כימיים סלקטיביים באמצעות פוליאניונים ואקציות דו-כיווניות או כימיקלים אחרים. בשנת 1950, הקבוצה של האוול הציעה לראשונה את המושג ליפופרוטאינים המוגדרים על ידי צפיפויות באמצעות ultracentrifugation וסיווגה אותם לצ’ילומיקרונים (CM), ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), ליפופרוטאינים בצפיפות בינונית (IDL), LDL ו- HDL5 ואילך, השיטה שונתה עוד יותר על ידי קבוצות אחרות6,7. עד כה, ultracentrifugation היא השיטה הפופולרית והאמינה ביותר בעוד הפרוטוקול המעשי עדיין אינו זמין. במאמר זה, ניסינו לתאר פרוטוקול קל לשימוש לבידוד קנה מידה קטן של פלזמה באמצעות ultracentrifugation צף צפיפות רציפה שתואר במקורבעבר 8. בידוד של שבעה שברי ליפופרוטאין פלזמה [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d = 1.02 g / mL), LDLs (d = 1.04 ו 1.06 g / mL), HDLs (d = 1.08, 1.10, ו 1.21 g/mL)] מאפשר לחוקרים לבצע ניתוח מקיף של ליפופרוטאינים והן של אפוליפופרוטאינים קומפוזיציוניים שלהם9,10,11. שלם שבעה ליפופרוטאינים בצפיפות רצופה ניתן להשתמש לניתוח פונקציות ליפופרוטאין וגם משרתים תא מבוסס במבחנה אסטרטגיות. פרוטוקול זה צריך להיות שימושי הן לאבחון קליני והן למחקר בסיסי. כאן השתמשנו פלזמה ארנב כדוגמה כדי להדגים טכניקה זו בעוד פלזמה ממינים אחרים ניתן ליישם באותו אופן.
Protocol
Representative Results
Discussion
היפרליפידמיה היא אחד מגורמי הסיכון החשובים ביותר של מחלה טרשת עורקים. לכן, ניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה הוא לא רק חיוני לאבחון של חולי דיסליפידמיה, אלא גם חשוב לחקירה של מנגנונים מולקולריים של חילוף החומרים ליפופרוטאין וטרשת עורקים. במחקר זה, תיארנו את הפרוטוקול של בידוד וניתוח של ליפופר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי מחקר מ JSPS KAKENHI גרנט מספר JP 20K08858, הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘81941001 ו 81770457), JSPS-CAS תחת התוכנית השיתופית מחקר יפן-סין.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
