العزل والتحليل من البروتينات الدهنية البلازما من قبل الطاردة الفائقة
Summary
وقد استخدمت عدة طرق لتحليل البروتين الدهني البلازما; ومع ذلك ، لا يزال الطرد الفائق واحدًا من أكثر الطرق شعبية وموثوقية. هنا، نحن وصف طريقة بشأن كيفية عزل البروتينات الدهنية من البلازما باستخدام كثافة متتابعة فائقة الrifugation وكيفية تحليل apolipoproteins لكل من أغراض التشخيص والبحث.
Abstract
تحليل البروتينات الدهنية والبلازمية و apolipoproteins هو جزء أساسي لتشخيص dyslipidemia ودراسات التمثيل الغذائي للدهون و تصلب الشرايين. على الرغم من وجود عدة طرق لتحليل البروتينات الدهنية البلازما، لا يزال الطرد الفائق التركيز واحدة من الأساليب الأكثر شعبية وموثوق بها. بسبب إجراء فصل سليمة، يمكن استخدام كسور البروتين الدهني المعزولة بواسطة هذه الطريقة لتحليل البروتينات الدهنية، apolipoproteins، البروتيوم، والدراسة الوظيفية للبروتينات الدهنية مع الخلايا المستزرعة في المختبر. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل سبعة كسور البروتينات الدهنية بما في ذلك VLDL (d< 1.006 ز / مل)، IDL (d = 1.02 ز / مل)، LDLs (د = 1.04 و 1.06 ز / مل)، HDLs (d = 1.08، 1.10، و 1.21 ز/مل) من بلازما الأرانب باستخدام الطرد فوق التخوم العائمة المتتابعة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم القراء كيفية تحليل apolipoproteins مثل apoA-I، apoB، وapoE من قبل SDS-PAGE وغربية النشاف وتظهر نتائج تمثيلية للروبوتات الدهنية وspopoprotein ملفات تعريف باستخدام نماذج الأرنب hyperlipidemic. يمكن أن تصبح هذه الطريقة بروتوكولًا قياسيًا لكل من الأطباء والعلماء الأساسيين لتحليل وظائف البروتين الدهني.
Introduction
ديسليبيديميا هو عامل الخطر الرئيسي لمرض تصلب الشرايين في العالم. ترتبط المستويات العالية من البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (LDLs) والمستويات المنخفضة من البروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDLs) بشكل وثيق مع ارتفاع خطر الإصابة بأمراض القلب التاجية (CHD)1،2. في الإعداد السريري، يتم قياس كل من LDL-الكولسترول (LDL-C) والكوليسترول HDL-CHOLESTEROL (HDL-C) بشكل روتيني باستخدام محلل آلي في مختبر سريري3،4. على الرغم من هذا، فمن الضروري لتحليل ملامح البروتين الدهني في التفاصيل لتشخيص dyslipidemia ودراسة التمثيل الغذائي للدهون و تصلب الشرايين في الحيوانات البشرية والتجريبية. وقد تم الإبلاغ عن عدة طرق لتحليل البروتين الدهني البلازما مثل الطرد الفائق المركز، وحجم استبعاد الكروماتوغرافيا [الكروماتوغرافيا السائلة البروتينية السريعة (FPLC) والكرومات السائلة عالية الأداء (HPLC))، والكهربائية بواسطة agarose و Polyacrylamide الهلام الهلام، الرنين المغناطيسي النووي، وانتقائية الكيميائية باستخدام البوليانيونس والالات الأرافينت أو غيرها من المواد الكيميائية. في الخمسينات، اقترحت مجموعة هافل لأول مرة مفهوم البروتينات الدهنية المحددة بالكثافة باستخدام الطارد الشديد وصنفتها في الكريومكيرونات (CM)، وبروتينات lipoproteins ذات الكثافة المنخفضة جداً (VLDL)، وبروتينات البروتينات الدهنية المتوسطة الكثافة (IDL)، وLDL، وHLDL5 وفيما بعد، تم تعديل الطريقة بشكل أكبر من قبل مجموعات أخرى6،7. حتى الآن، الطرد المفرط هو الأسلوب الأكثر شعبية وموثوق بها في حين أن البروتوكول العملي لا يزال غير متوفر. في هذه الورقة، حاولنا وصف بروتوكول سهل الاستخدام لعزل نطاق صغير من البلازما باستخدام كثافة متتابعة عائمة الrifugugation وصفت أصلا8. عزل سبعة كسور البروتين الدهني البلازما [VLDL (d< 1.006 ز / مل), IDL (d= 1.02 غرام / مل), LDLs (d= 1.04 و 1.06 ز /مل), HDLs (d= 1.08, 1.10, و 1.21 ز /مل]] تمكن الباحثين من إجراء تحليل مستفيض لكل من البروتينات الدهنية وبروتيناتها التركيبية9,10,11. ويمكن استخدام سبعة البروتينات الدهنية الكثافة على التوالي سليمة لتحليل وظائف البروتين الدهني وتخدم أيضا إلى الخلايا القائمة على استراتيجيات في المختبر. وينبغي أن يكون هذا البروتوكول مفيدا لكل من التشخيص السريري والبحوث الأساسية. هنا استخدمنا البلازما الأرانب كمثال لإثبات هذه التقنية في حين يمكن تطبيق البلازما من الأنواع الأخرى بنفس الطريقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد الدهون المفرطة من أهم عوامل الخطر لمرض تصلب الشرايين. وهكذا، تحليل البروتينات الدهنية البلازما ليس فقط ضروري لتشخيص مرضى dyslipidemia ولكن أيضا مهم للتحقيق في الآليات الجزيئية لعملية التمثيل الغذائي البروتين الدهني و تصلب الشرايين. في هذه الدراسة، وصفنا بروتوكول عزل وتحليل البروتينات الد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح بحثية من منحة JSPS KAKENHI رقم JP 20K08858، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81941001 و 81770457)، JSPS-CAS في إطار برنامج التعاونية البحثية اليابانية الصينية.
Materials
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
