Yetişkin Fare Yumurtalıklarında Doğru Folikül Numaralandırması
Summary
Burada, sabit fare yumurtalık dokularının doğru folikül sayımı için iki farklı tekniği açıklıyor, karşılaştırıyor ve karşılaştırıyoruz.
Abstract
Cinsel olarak üreyen dişi memeliler, ömür boyu oosit tedariki ile doğarlar. Olgunlaşmamış, sessiz oositler, dişi mikrop hattının depolama birimi olan ilkel foliküllerde bulunur. Yenilenemezler, bu nedenle doğumdaki sayıları ve sonraki kayıp oranları büyük ölçüde kadın doğurganlık ömrünü belirler. Kadınlarda ve hayvanlarda ilkel folikül sayılarının doğru ölçülmesi, ilaçların ve toksikantların yumurtalık rezervi üzerindeki etkisini belirlemek için gereklidir. Mevcut ve gelişmekte olan doğurganlık koruma tekniklerine duyulan ihtiyacı ve başarısını değerlendirmek için de gereklidir. Şu anda, kadınlarda yumurtalık rezervini oluşturan ilkel foliküllerin sayısını doğru bir şekilde ölçmek için herhangi bir yöntem bulunmamaktadır. Ayrıca, deney için büyük hayvanlardan veya nesli tükenmekte olan türlerden yumurtalık dokusu elde etmek genellikle mümkün değildir. Bu nedenle, fareler bu tür çalışmalar için önemli bir model haline gelmiştir ve tüm fare yumurtalıklarındaki ilkel folikül sayılarını değerlendirme yeteneği kritik bir araçtır. Bununla birlikte, literatürde fare yumurtalıklarındaki mutlak folikül sayıları raporları oldukça değişkendir, bu da verilerin karşılaştırılmasını ve/veya çoğaltılmasını zorlaştırır. Bunun nedeni, zorlanma, yaş, tedavi grupları gibi bir dizi faktörün yanı sıra kullanılan sayım yöntemlerindeki teknik farklılıklardır. Bu yazıda, histolojik bölümlerin hazırlanması ve fare yumurtalıklarındaki ilkel foliküllerin sayılması için iki farklı yöntem kullanarak adım adım bir öğretim kılavuzu sunuyoruz: [1] fraksiyonör / optik distör tekniğine dayanan stereoloji; ve [2] doğrudan sayım tekniği. Her yöntemin bazı temel avantajları ve dezavantajları vurgulanacak, böylece sahada tekrarlanabilirlik geliştirilebilir ve araştırmacıların çalışmaları için en uygun yöntemi seçmelerini sağlayacaktır.
Introduction
Yumurtalıktaki ilkel foliküller içinde depolanan olgunlaşmamış, meiyotik olarak tutuklanmış oositler, kadın germline için depolama birimidir ve bireyin yaşam boyu yumurtalık rezervini oluşturur. İlkel folikül sayıları1yaşla birlikte doğal olarak azalır veya alternatif olarak, hava, gıda ve sudaki bazı farmasötikler ve çevresel toksik maddeler de dahil olmak üzere ekzojen kimyasallara maruz kaldıktan sonra erken tükenebilir2. İlkel folikül sayısının sınırlı olduğu göz önüne alındığında, yumurtalıkta bulunan foliküllerin miktarı ve kalitesi büyük ölçüde kadın doğurganlığını ve yavru sağlığını belirler. Bu nedenle, kadınlarda ilkel folikül sayısının doğru ölçülmesi, eksojen hakaretlerin yumurtalık rezervi üzerindeki hedef dışı etkilerini değerlendirmek için gereklidir.
Kadınlarda, tüm yumurtalığın analizi genellikle mümkün değildir, bu nedenle yumurtalık rezervinin invaziv olmayan taşıyıcı önlemleri klinik bir ortamda kullanılmalıdır. Anti-Mϋllerian hormonu (AMH) klinik olarak en yaygın kullanılan taşıyıcı biyobelirteçtir3. Serum AMH düzeyleri genellikle ileri anne çağındaki kadınlarda veya kemoterapi gibi kanser tedavisinden önce ve sonra ölçülür. Bununla birlikte, AMH ilkel foliküller tarafından değil, büyüyen foliküller tarafından üretilir ve bu nedenle serum seviyeleri mutlak ilkel folikül sayısı hakkında bilgi vermemektedir.
Kadınlarda ilkel folikül sayısını doğru bir şekilde belirlemek için yöntemlerin bulunmaması ile in situ, kemirgenler gibi küçük hayvan modellerinde yumurtalık köklerini saymak, eksojen hakaretlerin ilkel foliküller ve dolayısıyla doğurganlık üzerindeki etkisini değerlendirmek için gerekli bir araştırma aracı olmaya devam etmektedir. Ne yazık ki, kemirgen modellerinde ilkel folikül sayılarının literatürü boyunca raporlar oldukça değişkendir4. Bunun önemli bir nedeni, kullanılan sayım yöntemindeki teknik farklılıklar yaygın olarak bildirilmektedir. Ağırlıklı olarak, literatürde farelerde ilkel foliküllerin numaralandırması için açıklanan iki farklı teknik vardır. Bunlar, fraksiyonatör optik disektör yöntemini kullanan stereoloji ve doğrudan folikül sayılarını içerir.
Stereology yaygın olarak kullanılan altın standart sistematik tekdüze rastgele örnekleme5, bütün fare veya sıçan yumurtalıkları4,6,7ilkel folikül sayısını ölçmenin en doğru yöntemidir. Stereology, ilgi çekici nesnenin üç boyutlu yapısını oluşturduğu için tarafsızdır8. Optik bir disektör/fraksiyonatör yöntemi kullanılarak, toplam fare yumurtalığının bilinen bir fraksiyonu içinde kalın doku bölümleri (örneğin, 20 μm) kullanılarak ilkel folikülleri ölçmek için üç örnekleme seviyesi uygulanır. İlk olarak, örnekleme aralığı rastgele bir başlangıçta (örneğin, her 3rd bölümde) seçilir (örnekleme fraksiyonu 1, f1)4. Bölümler daha sonra bu noktadan tüm yumurtalık boyunca sistematik, düzgün bir şekilde örneklenir. Daha sonra, tarafsız bir sayım çerçevesi yumurtalık bölümünün üzerine bindirilir ve tanımlı, randomize bir sayım ızgarası boyunca aşamalı olarak hareket ettirilir (örnekleme fraksiyonu 2, f2)8. Son olarak, kesit kalınlığının bilinen bir kısmı optik olarak örneklenir (örneğin, 10 μm) ve bu alandaki foliküller sayılır (örnekleme fraksiyonu 3, f3)4. Ham folikül sayısı, nihai değeri elde etmek için bu örnekleme fraksiyonlarının tersi ile çarpılır. Bu yöntem, stereolojik yazılım tarafından tahrik edilen motorlu bir aşamaya sahip bir mikroskop da dahil olmak üzere uzman eğitimi ve ekipmanı gerektirir. Dokular özel bir Bouin fiksatifinde korunmalı ve cam bıçaklı glikolmethakrilat reçine mikrotom kullanılarak kalın doku bölümlerinin kesilmesini sağlamak için glikolmethakrilat reçinesine gömülmelidir. Bu yöntem, yumurtalık ve foliküllerin üç boyutlu morfolojik yapısını en iyi şekilde korumak için doku büzülme ve deformasyonunu hesaba katmak için tasarlanmıştır9.
Doğrudan folikül sayımı, folikülleri saymak için en sık kullanılan yöntemdir10. Daha yaygın fiksatifler (formalin) kullanılabilir, ardından parafin balmumu gömme ve 4-6 μm arasında bir kalınlıkta standart bir mikrotom kullanılarak kapsamlı seri kesitler kullanılabilir. Foliküller tüm doku bölümünde tanımlanmış bir aralıkta sistematik olarak sayılır ve daha sonra toplam folikül tahminini elde etmek için örnekleme aralığının tersi ile çarpılır. Bu yöntem hızlı, kolaydır, arşivlenmiş dokular kullanılarak yapılabilir ve standart histolojik teknikler kullanılarak hazırlanabilir. Standart görüntüleme yeteneklerine sahip sadece bir ışık mikroskobu gerektirir. Bununla birlikte, bu avantajlara rağmen, doğrudan folikül sayımı, stereolojinin doğruluğundan ve katı sayım parametrelerinden yoksun olduğundan, araştırmacı önyargısına daha yatkın hale getirir. Ek olarak, dokular işlem sırasında büzülme ve deformasyona uğrayabilir, yumurtalığın bütünlüğünü ve morfolojisini bozabilir ve böylece folikül sınıflandırmasını ve nicelleştirmeyi zorlaştırabilir.
Bu makalenin amacı, fare yumurtalıklarındaki ilkel folikül sayısını nicel olarak değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan iki yöntemi açıklamaktır: stereoloji ve doğrudan folikül sayımı. Alanımızda tekrarlanabilirliği artırmak ve araştırmacıların çalışmaları için en uygun sayım yöntemi hakkında bilinçli bir karar vermelerini sağlamak için bu iki yöntem için ayrıntılı protokoller sağlayacağız ve bazı güçlü ve zayıf yönlerini vurgulayacağız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, fare ilkel folikülleri, stereolojiyi ve daha yaygın olarak kullanılan doğrudan folikül sayma yöntemini numaralandırmak için altın standart tekniği için adım adım bir protokol sağlanmıştır. Kemoterapi tedavisi, sol ve sağ yumurtalık içinde bu iki farklı yöntemden elde edilen sonuçları aynı hayvandan karşılaştırmak ve karşılaştırmak için kullanılmıştır. Her iki yöntem de ilkel folikül sayılarında hayvanlar arası yüksek değişkenliği ortaya koydu. Yumurtalık rezerv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapı Desteği ve Avustralya Hükümeti NHMRC IRIISS aracılığıyla mümkün oldu ve Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (ALW #1120300) ve Avustralya Araştırma Konseyi ‘nden (KJH #FT190100265) finanse edildi. Yazarlar Monash Hayvan Araştırma Platformu, Monash Histoloji Platformu ve Monash Mikro Görüntüleme tesisinin teknik desteğini kabul etmek istiyor.
Materials
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- Ristic, N., et al. Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring. Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).
- Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).
- Brown, D. L. Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology. Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).
- Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design. Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts–not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Nguyen, Q. N., et al. Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility. Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).
- Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice. Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).
- Winship, A. L., et al. The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation. Human Reproduction. , (2020).
- Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).
- Nguyen, Q. N., et al. Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes. Molecular Human Reproduction. , (2019).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).
- Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Omari, S., et al. Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve. Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).
- Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age. Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary. Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age. Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).
- Charleston, J. S., et al. Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem. Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).
- Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
- Hansen, K. R., et al. A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause. Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
