Enumeración exacta del folículo en ovarios adultos del ratón

Los ovocitos inmaduros, meiotically-arrestados almacenados dentro de los folículos primordiales en el ovario son la unidad de almacenamiento para la línea germinal femenina y comprenden la reserva ovárica de por vida de un individuo. Los números de folículos primordiales disminuyen naturalmente con la edad^{de 1,}o alternativamente, pueden agotarse prematuramente después de la exposición a productos químicos exógenos, incluidos algunos productos farmacéuticos y tóxicos ambientales en el aire, los alimentos y el agua^2. Dado que el número de folículos primordiales es finito, la cantidad y calidad de los folículos presentes en el ovario determinan en gran medida la fertilidad femenina y la salud de la descendencia. Así, la cuantificación exacta del número primordial del folículo en mujeres es esencial para evaluar los impactos fuera de la blanco de insultos exógenos en la reserva ovárica.

En las mujeres, el análisis de todo el ovario generalmente no es posible, por lo que las medidas sustitutas no invasivas de la reserva ovárica deben utilizarse en un entorno clínico. La hormona anti-mϋlleriana (AMH) es el biomarcador sustituto más utilizado clínicamente³. Los niveles séricos de AMH a menudo se miden en mujeres de edad materna avanzada, o antes y después del tratamiento del cáncer, como la quimioterapia. Sin embargo, la AMH es producida por folículos en crecimiento y no por folículos primordiales, y por lo tanto, los niveles séricos no informan sobre el número absoluto de folículos primordiales.

Con la ausencia de métodos para determinar con precisión el número de folículos primordiales en mujeres in situ,el recuento de folículos ováricos en modelos animales pequeños, como los roedores, sigue siendo una herramienta de investigación esencial para evaluar el grado en que los insultos exógenos impactan en los folículos primordiales y, por lo tanto, en la fertilidad. Desafortunadamente, sin embargo, los informes a lo largo de la literatura de los números de folículos primordiales en modelos de roedores son altamente^{variables 4}. Una de las principales razones de esto son las diferencias técnicas ampliamente reportadas en el método de conteo empleado. Predominantemente, hay dos técnicas diferentes descritas en la literatura para enumerar folículos primordiales en ratones. Estos incluyen la estereología, que emplea el método de disector óptico del fraccionador, y los recuentos directos de folículos.

La estereología es ampliamente considerada el patrón oro, ya que utiliza el muestreo aleatorio uniforme sistemático^5,por lo que es el método más preciso de cuantificar el número de folículos primordiales en ratones enteros, o ovarios de rata^4,6,7. La estereología es imparcial, ya que explica la estructura tridimensional del objeto de interés⁸. Utilizando un método de disector/fraccionador óptico, se aplican tres niveles de muestreo para cuantificar los folículos primordiales utilizando secciones gruesas de tejido (por ejemplo, 20 μm) dentro de una fracción conocida del ovario total del ratón. En primer lugar, se elige el intervalo de muestreo (por ejemplo, cada^3ª sección) al azar (fracción de muestreo 1, f₁₎^4. Las secciones se muestrea de una manera sistemática y uniforme desde este punto hasta todo el ovario. Luego, un marco de conteo imparcial se superpone sobre la sección ovárica y se mueve progresivamente a lo largo de una cuadrícula de conteo definida y aleatoria (fracción de muestreo 2, f₂₎^8. Por último, se muestrea ópticamente una fracción conocida del espesor de la sección (por ejemplo, 10 μm) y se cuentan los folículos dentro de esta área (fracción de muestreo 3, f₃₎^4. El número de folículos en bruto se multiplica por la inversa de estas fracciones de muestreo para obtener el valor final. Este método requiere capacitación y equipo de expertos, incluido un microscopio con una etapa motorizada impulsada por un software estereológico. Los tejidos deben preservarse en un fijador especializado de Bouin, e incrustarse en resina de glicolmetacrilato para permitir que las secciones gruesas de tejido se corten utilizando un microtome de resina de glicolmetacrilato con un cuchillo de vidrio. Este método está diseñado para explicar la contracción y deformación de los tejidos, para preservar mejor la estructura morfológica tridimensional del ovario y los folículos^9.

El conteo directo de folículos es el método más utilizado para contar folículos¹⁰. Se pueden usar fijadores más comunes (es decir, formol), seguidos de incrustación de cera de parafina y seccionamiento en serie exhaustivo utilizando un microtomo estándar a un espesor de entre 4-6 μm. Los folículos se cuentan sistemáticamente en toda la sección del tejido en un intervalo definido, y luego se multiplican por la inversa del intervalo de muestreo para obtener la estimación del folículo total. Este método es rápido, fácil, se puede realizar usando tejidos archivados, y preparado usando técnicas histológicas estándar. Requiere solamente un microscopio ligero con capacidades estándar de la proyección de imagen. Sin embargo, a pesar de estas ventajas, el conteo directo de folículos carece de la precisión y los parámetros de conteo estrictos de la estereología, lo que lo hace más propenso al sesgo del investigador. Además, los tejidos pueden sufrir contracción y deformación durante el procesamiento, interrumpiendo la integridad y la morfología del ovario y, por lo tanto, dificultando la clasificación y cuantificación del folículo.

El objetivo de este artículo es describir dos métodos de uso común para evaluar cuantitativamente el número de folículos primordiales en los ovarios de ratón: estereología y recuento directo de folículos. Proporcionaremos protocolos detallados para estos dos métodos y destacaremos algunas de sus fortalezas y debilidades, con el fin de mejorar la reproducibilidad en nuestro campo y permitir a los investigadores tomar una decisión informada del método de conteo más apropiado para sus estudios.