Точное перечисление фолликула в яичниках взрослых мышей

Незрелые, меиотически арестованных яйцеклеток, хранящихся в изначальных фолликулов в яичнике являются единицей хранения для женской зародышевой линии и составляют пожизненный резерв яичников человека. Изначальные номера фолликулов снижаются естественным образом^{с возрастом 1}, или же, может быть преждевременно истощены после воздействия экзогенных химических веществ, в том числе некоторые фармацевтические препараты и экологические токсиканты в воздухе, пище и воде². Учитывая, что изначальное число фолликулов является конечным, количество и качество фолликулов, присутствующих в яичнике в значительной степени определить женскую плодовитости и здоровья потомства. Таким образом, точная количестве изначальных фолликулов у женщин имеет важное значение для оценки внецелевых воздействий экзогенных оскорблений на резерв яичников.

У женщин анализ всего яичника, как правило, не возможно, поэтому неинвазивные суррогатные меры резерва яичников должны быть использованы в клинических условиях. Анти-Mϋllerian гормона (AMH) является наиболее широко используемым суррогатным биомаркером клинически³. Уровни АМГ сыворотки часто измеряются у женщин преклонного материнского возраста или до и после лечения рака, например, химиотерапии. Тем не менее, AMH производится растущими фолликулами, а не изначальными фолликулами, и, таким образом, уровни сыворотки не сообщают об абсолютном количестве изначальных фолликулов.

При отсутствии методов точного определения количества изначальных фолликулов у женщин на месте, подсчет фолликуловяичников в мелких животных моделях, таких как грызуны, остается важным инструментом исследования для оценки степени, с помощью которой экзогенные оскорбления влияют на изначальные фолликулы и, следовательно, плодовитости. К сожалению, хотя, доклады по всей литературе изначальных фолликулов номера в моделях грызунов являются весьма^{переменной 4}. Одной из основных причин этого являются широко используемые технические различия в методе подсчета голосов. Преимущественно, Есть два различных методов, описанных в литературе для перечисления изначальных фолликулов у мышей. К ним относятся стереология, которая использует метод оптического препаратора фракциотора, и прямые отсчеты фолликулов.

Стереология широко рассматривается золотой стандарт, как он использует систематические равномерной^{случайной выборки 5}, что делает его наиболее точным методом количественной изначальной числа фолликула в целом мыши, или крысы^{яичников 4,6,7}. Стереология непредвзята, так как она объясняет трехмерную структуру объекта интереса⁸. Используя метод оптического рассечения/фракционного метода, три уровня выборки применяются для количественной оценки изначальных фолликулов с использованием толстых секций тканей (например, 20 мкм) в пределах известной доли от общего яичника мыши. Во-первых, выбран интервал отбора проб (например, каждый 3-й раздел) при случайном запуске (выборка фракции 1, f₁)^4. Разделы затем пробы в систематической, равномерной манере с этого момента через весь яичник. Затем, непредвзятый подсчет кадра накладывается на секцию яичников и постепенно перемещается по определенной, рандомизированной сетке подсчета (выборка фракция 2, f₂)⁸. Наконец, известная доля толщины секции оптически пробы (например, 10 мкм) и фолликулы в этой области учитываются (выборка фракции 3, f₃)⁴. Количество необработанных фолликулов умножается на обратные эти фракции выборки для получения конечного значения. Этот метод требует экспертной подготовки и оборудования, в том числе микроскопа с моторизованной стадией, управляемой стереологическим программным обеспечением. Ткани должны быть сохранены в специализированной фиксатор Буин, и встроенные в гликольметакрилат смолы, чтобы для толстых секций ткани, которые будут сокращены с помощью микротома гликольметакрилат смолы со стеклянным ножом. Этот метод предназначен для учета усадки тканей и деформации, чтобы наилучшим образом сохранить трехмерную морфологическую структуру яичников и^{фолликулов 9.}

Прямой подсчет фолликулов является наиболее часто используемым методом подсчета фолликулов¹⁰. Можно использовать более распространенные фиксаторы (т.е. формалин), за которыми следует встраивание парафинового воска и исчерпывающее последовательное сечение с использованием стандартного микротома толщиной от 4 до 6 мкм. Фолликулы систематически подсчитываются во всей секции тканей через определенный интервал, а затем умножаются на обратный интервал выборки для получения общей оценки фолликула. Этот метод быстрый, простой, может быть выполнен с использованием архивных тканей, и подготовлен с использованием стандартных гистологических методов. Для этого требуется только световой микроскоп со стандартными возможностями визуализации. Однако, несмотря на эти преимущества, прямой подсчет фолликулов не хватает точности и строгих параметров подсчета стереологии, что делает его более склонным к следователю предвзятости. Кроме того, ткани могут подвергаться усадки и деформации во время обработки, нарушая целостность и морфологию яичников и тем самым делая классификацию фолликулов и количественной оценки трудно.

Цель этой статьи состоит в том, чтобы описать два широко используемых метода количественной оценки числа изначальных фолликулов в яичниках мыши: стереология и прямой подсчет фолликулов. Мы предоставим подробные протоколы для этих двух методов и подчеркем некоторые из их сильных и слабых сторон, с тем чтобы повысить воспроизводимость в нашей области и позволить исследователям принять обоснованное решение о наиболее подходящем методе подсчета для своих исследований.