Enumerazione accurata del follicolo nelle ovaie di topo adulto

Gli ovociti immaturi, arrestati meioticamente immagazzinati all’interno di follicoli primordiali nell’ovaio sono l’unità di stoccaggio della linea germinale femminile e comprendono la riserva ovarica a vita di un individuo. Il numero primordiale di follicoli diminuisce naturalmente^{con l’età di 1}, o in alternativa, può essere prematuramente impoverito a seguito dell’esposizione a sostanze chimiche esogene, tra cui alcuni prodotti farmaceutici e sostanze tossiche ambientali nell’aria, negli alimenti e^{nell’acqua 2}. Dato che il numero primordiale del follicolo è finito, la quantità e la qualità dei follicoli presenti all’interno dell’ovaio determinano in gran parte la fertilità femminile e la salute della prole. Pertanto, una quantificazione accurata del numero primordiale di follicoli nelle donne è essenziale per valutare gli impatti fuori bersaglio degli insulti esogeni sulla riserva ovarica.

Nelle donne, l’analisi dell’intera ovaia non è generalmente possibile, quindi le misure surrogate non invasive della riserva ovarica devono essere utilizzate in un ambiente clinico. L’Mϋllerian anti-Mϋllerian (AMH) è il biomarcatore surrogato più utilizzato clinicamente³. I livelli di AMH sierico sono spesso misurati nelle donne in età materna avanzata, o prima e dopo il trattamento del cancro, come la chemioterapia. Tuttavia, l’AMH è prodotto dalla crescita dei follicoli e non dai follicoli primordiali, e quindi, i livelli del siero non informano sul numero primordiale assoluto del follicolo.

Con l’assenza di metodi per determinare con precisione il numero primordiale di follicoli nelle donne in situ, il conteggio dei follicoli ovarico in piccoli modelli animali, come i roditori, rimane uno strumento di ricerca essenziale per valutare il grado in cui gli insulti esogeni hanno un impatto sui follicoli primordiali e quindi sulla fertilità. Sfortunatamente, tuttavia, i rapporti in tutta la letteratura sui numeri primordiali dei follicoli nei modelli di roditori sono altamente^{variabili 4}. Una delle ragioni principali di ciò sono le differenze tecniche ampiamente riportate nel metodo di conteggio utilizzato. Prevalentemente, ci sono due diverse tecniche descritte nella letteratura per enumerare i follicoli primordiali nei topi. Questi includono la stereologia, che utilizza il metodo del dissector ottico del frazionatore, e il conteggio diretto dei follicoli.

La stereologia è ampiamente considerata il gold standard in quanto utilizza un campionamento casuale uniforme^{sistematico 5}, rendendolo il metodo più accurato per quantificare il numero primordiale del follicolo nell’intero topo, o ovaie^{di ratto 4,6,7}. La stereologia è imparziale, in quanto spiega la struttura tridimensionale dell’oggetto di interesse⁸. Utilizzando un metodo di dissector/frazionatore ottico, vengono applicati tre livelli di campionamento per quantificare i follicoli primordiali utilizzando sezioni di tessuto spesse (ad esempio, 20 μm) all’interno di una frazione nota dell’ovaio totale del topo. In primo luogo, l’intervallo di campionamento viene scelto (ad esempio, ogni 3^rd section) ad un inizio casuale (frazione di campionamento 1, f₁)⁴. Le sezioni vengono quindi campionare in modo sistematico e uniforme da questo punto attraverso l’intera ovaia. Quindi, un sistema di conteggio imparziale viene sovrapposto alla sezione ovarica e progressivamente spostato lungo una griglia di conteggio definita e randomizzata (frazione di campionamento 2, f₂)⁸. Infine, una frazione nota dello spessore della sezione viene campionato otticamente (ad esempio, 10 μm) e vengono conteggiati i follicoli all’interno di quest’area (frazione di campionamento 3, f₃)⁴. Il numero del follicolo grezzo viene moltiplicato per l’inverso di queste frazioni di campionamento per ottenere il valore finale. Questo metodo richiede una formazione e attrezzature esperte, incluso un microscopio con uno stadio motorizzato guidato da software stereologico. I tessuti devono essere conservati in un fixativo di Bouin specializzato e incorporati nella resina glicolemetacrilato per consentire il taglio di sezioni di tessuto spesse utilizzando un microtomo di resina glicolemetacrilato con un coltello di vetro. Questo metodo è progettato per tenere conto del restringimento e della deformazione tissutale, per preservare al meglio la struttura morfologica tridimensionale dell’ovaio e dei follicoli⁹.

Il conteggio diretto dei follicoli è il metodo più utilizzato per contare i^{follicoli 10}. Possono essere utilizzati fissivi più comuni (cioè formalina), seguiti da incorporamento di cera di paraffina e sessatura seriale esaustiva utilizzando un microtomo standard con uno spessore compreso tra 4-6 μm. I follicoli vengono sistematicamente conteggiati nell’intera sezione tissutale ad un intervallo definito, e quindi moltiplicati per l’inverso dell’intervallo di campionamento per ottenere la stima totale del follicolo. Questo metodo è rapido, facile, può essere eseguito utilizzando tessuti archiviati e preparato utilizzando tecniche istologiche standard. Richiede solo un microscopio a luce con funzionalità di imaging standard. Tuttavia, nonostante questi vantaggi, il conteggio diretto dei follicoli manca dell’accuratezza e dei rigorosi parametri di conteggio della stereologia, rendendolo più incline ai pregiudizi degli investigatori. Inoltre, i tessuti possono subire restringimento e deformazione durante la lavorazione, interrompendo l’integrità e la morfologia dell’ovaio e rendendo così difficile la classificazione e la quantificazione dei follicoli.

Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere due metodi comunemente usati per valutare quantitativamente il numero primordiale di follicoli nelle ovaie del topo: stereologia e conteggio diretto dei follicoli. Forniremo protocolli dettagliati per questi due metodi ed evidenzieremo alcuni dei loro punti di forza e di debolezza, al fine di migliorare la riproducibilità nel nostro campo e consentire ai ricercatori di prendere una decisione informata sul metodo di conteggio più appropriato per i loro studi.