Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Die unreifen, meiotisch verhafteten Eizellen, die in Urfollikel im Eierstock gelagert werden, sind die Lagereinheit für die weibliche Keimbahn und bilden die lebenslange Eierstockreserve eines Individuums. Primordial Follikel Zahlen sinken natürlich mit dem Alter¹, oder alternativ, kann vorzeitig nach der Exposition gegenüber exogenen Chemikalien, einschließlich einiger Pharmazeutika und Umweltgifte in Luft, Lebensmittel und Wasser². Da die ursprüngliche Follikelzahl endlich ist, bestimmen die Menge und Qualität der Follikel innerhalb des Eierstocks weitgehend die weibliche Fruchtbarkeit und die Gesundheit der Nachkommen. Daher ist eine genaue Quantifizierung der Urfollikelzahl bei Frauen für die Bewertung der außerhalb des Ziels von exogenen Beleidigungen auf die Eierstockreserve wichtigen Bedeutung.

Bei Frauen ist eine Analyse des gesamten Eierstocks im Allgemeinen nicht möglich, so dass nicht-invasive Ersatzmaßnahmen der Ovarialreserve in einem klinischen Umfeld eingesetzt werden müssen. Das Anti-M-Llerian-Hormon (AMH) ist der am weitesten verbreitete Ersatz-Biomarker klinisch³. Serum AMH-Spiegel werden oft bei Frauen im fortgeschrittenen mütterlichen Alter oder vor und nach der Krebsbehandlung, wie Chemotherapie, gemessen. AMH wird jedoch durch den Anbau von Follikel und nicht durch Urfollikel erzeugt, und daher informieren serumspiegel nicht über die absolute Urfollikelzahl.

Da es keine Methoden gibt, um die Primordialzahl bei Frauen in situgenau zu bestimmen, bleibt die Zählung der Eierstockfollikel in Kleintiermodellen wie Nagetieren ein wesentliches Forschungsinstrument, um zu beurteilen, inwieweit exogene Beleidigungen Auswirkungen auf die Urfollikel und damit auf die Fruchtbarkeit haben. Leider sind die Berichte in der gesamten Literatur über urfolgische Zahlen in Nagetiermodellen sehr variabel⁴. Ein Hauptgrund dafür sind weithin berichtete technische Unterschiede in der eingesetzten Zählmethode. Vor allem gibt es zwei verschiedene Techniken, die in der Literatur beschrieben werden, um Urfollikel bei Mäusen aufzuzählen. Dazu gehören die Stereologie, die die optische Dissektormethode des Fraktionators verwendet, und die Anzahl der direkten Follikel.

Die Stereologie wird weithin als Goldstandard angesehen, da sie systematische einheitliche Stichproben⁵verwendet, was sie zur genauesten Methode zur Quantifizierung der urtypischen Follikelzahl in der ganzen Maus oder Ratteneierstöcke^4,6,7macht. Die Stereologie ist unvoreingenommen, da sie die dreidimensionale Struktur des^Objektsvon Interesse 8 berücksichtigt. Mit Hilfe einer optischen Dissektor-/Fraktionatormethode werden drei Stichprobenebenen angewendet, um Urfollikel mit dicken Gewebeabschnitten (z. B. 20 m) innerhalb eines bekannten Bruchteils des gesamten Mausovarials zu quantifizieren. Zunächst wird das Stichprobenintervall (z. B. jeder^dritte Abschnitt) zu einem zufälligen Start gewählt (Sampling-Fraktion 1, f₁)⁴. Die Abschnitte werden dann systematisch und einheitlich von diesem Punkt an durch den gesamten Eierstock abgetastet. Dann wird ein unvoreingenommener Zählrahmen über dem Eierstockbereich überlagert und nach und nach entlang eines definierten, randomisierten Zählrasters bewegt (Sampling-Fraktion 2, f₂)⁸. Schließlich wird ein bekannter Bruchteil der Schnittdicke optisch beprobt (z.B. 10 m) und Follikel in diesem Bereich gezählt (Probenahmefraktion 3, f₃)⁴. Die rohe Follikelzahl wird mit der Umkehrung dieser Stichprobenfraktionen multipliziert, um den Endwert zu erhalten. Diese Methode erfordert eine fachkundige Schulung und Ausrüstung, einschließlich eines Mikroskops mit einer motorisierten Bühne, die von stereologischer Software angetrieben wird. Gewebe sollten in einem speziellen Bouin-Fixativ konserviert und in Glycolmethacrylatharz eingebettet werden, damit dicke Gewebeabschnitte mit einem Glycolmethacrylatharz-Mikrotom mit einem Glasmesser geschnitten werden können. Diese Methode wurde entwickelt, um Gewebeschrumpfung und Verformung zu berücksichtigen, um die dreidimensionale morphologische Struktur des Eierstocks und der Follikel am besten zu erhalten⁹.

Die direkte Follikelzählung ist die am häufigsten verwendete Methode zum Zählen von Follikel¹⁰. Es können häufigere Fixative (d. h. Formalin) verwendet werden, gefolgt von Paraffinwachseinbettung und erschöpfender serieller Schnitte mit einem Standardmikrotome mit einer Dicke zwischen 4 und 6 m. Follikel werden systematisch im gesamten Gewebeabschnitt in einem definierten Intervall gezählt und dann mit der Umkehrung des Probenahmeintervalls multipliziert, um die Gesamtfollikelschätzung zu erhalten. Diese Methode ist schnell und einfach, kann mit archivierten Geweben durchgeführt und mit standardmäßigen histologischen Techniken vorbereitet werden. Es erfordert nur ein Lichtmikroskop mit Standard-Bildgebungsfunktionen. Trotz dieser Vorteile fehlt es der direkten Follikelzählung jedoch an Genauigkeit und strengen Zählparametern der Stereologie, was sie anfälliger für Voreingenommenheit der Prüfer macht. Darüber hinaus können Gewebe während der Verarbeitung schrumpfen und verformt werden, wodurch die Integrität und Morphologie des Eierstocks gestört wird und somit die Follikelklassifizierung und -quantifizierung erschwert wird.

Ziel dieses Artikels ist es, zwei häufig verwendete Methoden zur quantitativen Bewertung der Urfollikelzahl in den Eierstöcken der Maus zu beschreiben: Stereologie und direkte Follikelzählung. Wir werden detaillierte Protokolle für diese beiden Methoden bereitstellen und einige ihrer Stärken und Schwächen aufzeigen, um die Reproduzierbarkeit in unserem Bereich zu verbessern und es den Forschern zu ermöglichen, eine fundierte Entscheidung über die am besten geeignete Zählmethode für ihre Studien zu treffen.