Nauwkeurige follikelenumatie in volwassen muiseronden

De onrijpe, meiotically-gearresteerde oöcyten die in primordiale follikels in de eierstok worden opgeslagen zijn de opslageenheid voor de vrouwelijke kiembaan en omvatten de het leven eierstokreserve van een individu. Primordiale follikels nemen op natuurlijke wijze af met de leeftijd^{van 1}jaar, of kunnen als alternatief voortijdig worden uitgeput na blootstelling aan exogene chemicaliën, waaronder sommige geneesmiddelen en milieutoxische stoffen in lucht, voedsel en water². Aangezien het primordiale follikelgetal eindig is, bepalen de hoeveelheid en kwaliteit van de follikels in de eierstok grotendeels de vrouwelijke vruchtbaarheid en de gezondheid van nakomelingen. Nauwkeurige kwantificering van het primordiale follikelgetal bij vrouwen is dus essentieel voor het evalueren van de off-target effecten van exogene beledigingen op de ovariële reserve.

Bij vrouwen is analyse van de hele eierstok over het algemeen niet mogelijk, dus niet-invasieve surrogaatmetingen van de eierstokreserve moeten in een klinische omgeving worden gebruikt. Anti-Mħllerian hormoon (AMH) is de meest gebruikte surrogaat biomarker klinisch³. Serum AMH-spiegels worden vaak gemeten bij vrouwen van gevorderde leeftijd van de moeder, of voor en na de behandeling van kanker, zoals chemotherapie. AMH wordt echter geproduceerd door groeiende follikels en niet door primordiale follikels, en dus informeren serumspiegels niet over het absolute primordiale follikelgetal.

Met de afwezigheid van methoden om het primordiale follikelgetal bij vrouwen in situnauwkeurig te bepalen, blijft het tellen van ovariële follikels in kleine diermodellen, zoals knaagdieren, een essentieel onderzoeksinstrument om de mate te beoordelen waarmee exogene beledigingen invloed hebben op primordiale follikels en dus vruchtbaarheid. Helaas zijn rapporten in de literatuur van primordiale follikelgetallen in knaagdiermodellen zeer variabel⁴. Een belangrijke reden hiervoor zijn de wijdverspreide technische verschillen in de toegepaste telmethode. In de literatuur worden twee verschillende technieken beschreven voor het opsommen van primordiale follikels bij muizen. Deze omvatten stereologie, die de fractionator optische dissector methode gebruikt, en directe follikeltellingen.

Stereologie wordt algemeen beschouwd als de gouden standaard omdat het systematische uniforme willekeurige bemonstering^{gebruikt 5}, waardoor het de meest nauwkeurige methode is om primordiaal follikelgetal in hele muis te kwantificeren, of ratteneierstokken^4,6,7. Stereologie is onbevooroordeeld, omdat het de driedimensionale structuur van het object van belang^{verklaart 8}. Met behulp van een optische dissector/fractionatormethode worden drie bemonsteringsniveaus toegepast om primordiale follikels te kwantificeren met behulp van dikke weefselsecties (bv. 20 μm) binnen een bekende fractie van de totale eierstok van de muis. Ten eerste wordt het bemonsteringsinterval gekozen (bv. elke^3e sectie) bij een willekeurige start (bemonsteringsfractie 1, f₁)⁴. Secties worden vervolgens vanaf dit punt op een systematische, uniforme manier door de hele eierstok bemonsterd. Vervolgens wordt een onbevooroordeeld telkader over de eierstoksectie gesupercipeerd en geleidelijk verplaatst langs een gedefinieerd, gerandomiseerd telraster (bemonsteringsfractie 2, f₂)⁸. Ten slotte wordt een bekende fractie van de doorsnededikte optisch bemonsterd (bv. 10 μm) en worden follikels in dit gebied geteld (bemonsteringsfractie 3, f₃)⁴. Het ruwe follikelgetal wordt vermenigvuldigd met de inverse van deze bemonsteringsfracties om de eindwaarde te verkrijgen. Deze methode vereist deskundige training en apparatuur, waaronder een microscoop met een gemotoriseerd podium aangedreven door stereologische software. Weefsels moeten worden bewaard in het fixatieve van een gespecialiseerde Bouin en ingebed in glycolmethacrylaathars om dikke weefselsecties te kunnen snijden met behulp van een microtome van glycolmethacrylaathars met een glazen mes. Deze methode is ontworpen om weefselkrimp en vervorming te verklaren, om de driedimensionale morfologische structuur van de eierstok en follikels het beste te behouden⁹.

Direct follikeltelling is de meest gebruikte methode voor het tellen van follikels¹⁰. Meer voorkomende fixatieven (d.w.z. formaline) kunnen worden gebruikt, gevolgd door inbedding van paraffinewas en uitputtende seriële doorsneden met behulp van een standaardmicrotome met een dikte tussen 4-6 μm. Follikels worden systematisch geteld in de gehele weefselsectie met een bepaald interval en vervolgens vermenigvuldigd met de inverse van het bemonsteringsinterval om de totale follikelraming te verkrijgen. Deze methode is snel, eenvoudig, kan worden uitgevoerd met behulp van gearchiveerde weefsels en worden bereid met behulp van standaard histologische technieken. Het vereist alleen een lichtmicroscoop met standaard beeldvormingsmogelijkheden. Ondanks deze voordelen mist direct follikeltelling echter de nauwkeurigheid en strikte telparameters van stereologie, waardoor het vatbaarder is voor onderzoeksbias. Bovendien kunnen weefsels krimp en vervorming ondergaan tijdens de verwerking, waardoor de integriteit en morfologie van de eierstok worden verstoord en follikelclassificatie en kwantificering moeilijk worden.

Het doel van dit artikel is om twee veelgebruikte methoden te beschrijven om het primordiale follikelgetal in de eierstokken van muizen kwantitatief te beoordelen: stereologie en directe follikeltelling. We zullen gedetailleerde protocollen voor deze twee methoden verstrekken en enkele van hun sterke en zwakke punten benadrukken, om de reproduceerbaarheid in ons vakgebied te verbeteren en onderzoekers in staat te stellen een weloverwogen beslissing te nemen over de meest geschikte telmethode voor hun studies.