تعداد دقيق للجريب في مبايض الفئران للبالغين
Summary
هنا، ونحن نصف، مقارنة، وعلى النقيض من اثنين من تقنيات مختلفة لعد جريب دقيقة من أنسجة المبيض الماوس الثابتة.
Abstract
ولدت الثدييات الإناث استنساخ جنسيا مع كامل إمداداتها مدى الحياة من البويضات. توجد البويضات غير الناضجة والكئيبة داخل بصيلات بدائية ، وحدة تخزين الجرثومة الأنثوية. وهي غير قابلة للتجديد، وبالتالي فإن عددها عند الولادة ومعدل الخسارة اللاحق يملي إلى حد كبير عمر الخصوبة للإناث. يعد التحديد الكمي الدقيق لأعداد الجريبات البدائية لدى النساء والحيوانات أمرا ضروريا لتحديد تأثير الأدوية والمواد السامة على احتياطي المبيض. كما أنه ضروري لتقييم الحاجة إلى تقنيات حفظ الخصوبة القائمة والناشئة ونجاحها. حاليا، لا توجد طرق لقياس بدقة عدد بصيلات البدائية التي تتألف من احتياطي المبيض لدى النساء. وعلاوة على ذلك، فإن الحصول على أنسجة المبيض من الحيوانات الكبيرة أو الأنواع المهددة بالانقراض للتجارب غالبا ما يكون غير ممكن. وهكذا، أصبحت الفئران نموذجا أساسيا لمثل هذه الدراسات، والقدرة على تقييم أعداد الجريبات البدائية في مبايض الفئران بأكملها هي أداة حاسمة. ومع ذلك، فإن التقارير عن الأرقام المطلقة للجريب في مبايض الفئران في الأدبيات متغيرة للغاية، مما يجعل من الصعب مقارنة و/أو تكرار البيانات. ويرجع ذلك إلى عدد من العوامل بما في ذلك الإجهاد والعمر والمجموعات العلاجية، فضلا عن الاختلافات التقنية في أساليب العد المستخدمة. في هذه المقالة، نقدم دليل تعليمي خطوة بخطوة لإعداد المقاطع النسيجية والعد بصيلات بدائية في مبايض الفئران باستخدام طريقتين مختلفتين: [1] علم التجسيم، الذي يعتمد على تقنية التشريح/التشريح البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية التشريح الجزئي/البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيمات/ التجسيم البصري؛ [1] التجسيمات الأنسجةية؛ [1] التجسيم، الذي يعتمد على تقنية الكسر/التشريح البصري؛ [1] التجسيم/ التجريب البصري؛ و [2] تقنية العد المباشر. وسيتم تسليط الضوء على بعض المزايا والعيوب الرئيسية لكل طريقة بحيث يمكن تحسين القابلية للاستنساخ في هذا المجال وتمكين الباحثين من اختيار الطريقة الأنسب لدراساتهم.
Introduction
البويضات غير الناضجة الموقوفة من الناحية العضلية المخزنة داخل بصيلات بدائية في المبيض هي وحدة تخزين الجرثومة الأنثوية وتشكل احتياطي المبيض مدى الحياة للفرد. أعداد الجريبات البدائية تنخفض بشكل طبيعي مع سن1، أو بدلا من ذلك ، يمكن أن تستنفد قبل الأوان بعد التعرض للمواد الكيميائية الخارجية ، بما في ذلك بعض المستحضرات الصيدلانية والمواد السامة البيئية في الهواء والغذاء والماء2. وبالنظر إلى أن عدد الجريبات البدائية محدود ، فإن كمية ونوعية الجريبات الموجودة داخل المبيض تحدد إلى حد كبير خصوبة الإناث وصحة النسل. وبالتالي، فإن التحديد الكمي الدقيق لعدد الجريبات البدائية لدى النساء أمر ضروري لتقييم الآثار غير المستهدفة للإهانات الخارجية على احتياطي المبيض.
في النساء، تحليل المبيض كله غير ممكن عموما، وبالتالي يجب استخدام التدابير البديلة غير الغازية لاحتياطي المبيض في بيئة سريرية. هرمون مكافحة Mϋllerian (AMH) هو العلامة الحيوية البديلة الأكثر استخداماسريريا 3. غالبا ما تقاس مستويات الأمصال لدى النساء في سن الأمومة المتقدمة، أو قبل وبعد علاج السرطان، مثل العلاج الكيميائي. ومع ذلك، يتم إنتاج AMH عن طريق زراعة بصيلات وليس عن طريق بصيلات بدائية، وبالتالي، مستويات المصل لا تبلغ عن عدد جريب البدائية المطلقة.
مع عدم وجود طرق لتحديد بدقة عدد الجريبات البدائية في النساء في الموقع، فإن عد بصيلات المبيض في نماذج الحيوانات الصغيرة ، مثل القوارض ، يبقى أداة بحثية أساسية لتقييم الدرجة التي تؤثر بها الإهانات الخارجية على الجريبات البدائية وبالتالي الخصوبة. للأسف على الرغم من, تقارير في جميع أنحاء الأدب من أعداد بصيلات البدائية في نماذج القوارض هي متغير للغاية4. ومن الأسباب الرئيسية لذلك الاختلافات التقنية المبلغ عنها على نطاق واسع في طريقة العد المستخدمة. في الغالب ، هناك تقنيتان مختلفتان موضحتان في الأدبيات لتعداد الجريبات البدائية في الفئران. وتشمل هذه المجسمة، التي تستخدم طريقة التشريح البصري الكسري، وتهم المسام المباشرة.
يعتبر علم المجسمة على نطاق واسع معيار الذهب لأنه يستخدم منهجية موحدة أخذالعينات العشوائية 5، مما يجعلها الطريقة الأكثر دقة لتحديد عدد المسام البدائية في الماوس كله ، أو المبيضين الفئران4،6،7. الستيرولوجيا غير متحيزة ، لأنها تمثل بنية ثلاثية الأبعاد للكائن المثير للاهتمام8. باستخدام طريقة تشريح بصري / كسر ، يتم تطبيق ثلاثة مستويات من أخذ العينات لتحديد الجريبات البدائية باستخدام أقسام الأنسجة السميكة (على سبيل المثال ، 20 ميكرومتر) ضمن جزء معروف من إجمالي مبيض الماوس. أولا، يتم اختيار الفاصل الزمني لأخذ العينات (على سبيل المثال، كل قسم 3rd) في بداية عشوائية (أخذ العينات كسر 1، و1)4. ثم يتم أخذ عينات من الأقسام بطريقة منهجية وموحدة من هذه النقطة من خلال المبيض بأكمله. ثم، يتم فرض إطار عد غير متحيزة على قسم المبيض وتحرك تدريجيا على طول شبكة عد محددة وعشوائية (أخذ العينات كسر 2، و2)8. وأخيرا، يتم أخذ عينات بصرية من جزء معروف من سمك القسم (على سبيل المثال، 10 ميكرومتر) ويتم احتساب الجريبات داخل هذه المنطقة (أخذ عينات الكسر 3، و3)4. يتم ضرب عدد الجريبات الخام في عكس هذه الكسور أخذ العينات للحصول على القيمة النهائية. تتطلب هذه الطريقة تدريب الخبراء والمعدات، بما في ذلك المجهر مع مرحلة الآلية التي يقودها البرمجيات stereological. وينبغي الحفاظ على الأنسجة في المثبتة بوين المتخصصة، وجزءا لا يتجزأ من راتنج غليكولميثاكريلات للسماح لقطع أقسام الأنسجة السميكة باستخدام ميكروتوم راتنج غليكولميتهاكريلات مع سكين زجاجية. تم تصميم هذه الطريقة لحساب انكماش الأنسجة وتشوه، للحفاظ على أفضل بنية مورفولوجية ثلاثية الأبعاد للمبيض وبصيلات9.
عد الجريبات المباشر هو الطريقة الأكثر استخداما لعد بصيلات10. يمكن استخدام مثبتات أكثر شيوعا (أي الفورماتين) ، يليها تضمين شمع البارافين والقسم التسلسلي الشامل باستخدام ميكروتوم قياسي بسماكة تتراوح بين 4-6 ميكرومتر. يتم احتساب الجريبات بشكل منهجي في قسم الأنسجة بأكمله على فاصل زمني محدد ، ثم تضرب في عكس الفاصل الزمني لأخذ العينات للحصول على تقدير الجريب الكلي. هذه الطريقة سريعة وسهلة ، ويمكن القيام بها باستخدام الأنسجة المؤرشفة ، وإعدادها باستخدام تقنيات الأنسجة القياسية. لا يتطلب سوى مجهر خفيف مع قدرات التصوير القياسية. ومع ذلك ، على الرغم من هذه المزايا ، فإن العد المباشر للجريب يفتقر إلى الدقة والمعلمات العد الصارمة للتسريو ، مما يجعله أكثر عرضة لتحيز المحقق. بالإضافة إلى ذلك ، قد تخضع الأنسجة للانكماش والتشوه أثناء المعالجة ، مما يعطل سلامة المبيض ومورفولوجياه ، وبالتالي يجعل تصنيف الجريبات وتحديد كميتها أمرا صعبا.
الهدف من هذه المقالة هو وصف طريقتين شائعتي الاستخدام لتقييم عدد الجريبات البدائية كميا في مبايض الماوس: الستيرولوجيا والعد المباشر للجريب. وسوف نقدم بروتوكولات مفصلة لهذين الأسلوبين وتسليط الضوء على بعض نقاط القوة والضعف، من أجل تعزيز الاستنساخ في مجالنا والسماح للباحثين لاتخاذ قرار مستنير من طريقة العد الأنسب لدراساتهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لتقنية معيار الذهب تعداد بصيلات الماوس الأولية، مجسمة، وطريقة أكثر شيوعا المستخدمة من الجريبات المباشرة العد. تم استخدام العلاج الكيميائي لمقارنة وتباين النتائج التي تم الحصول عليها من هاتين الطريقتين المختلفتين داخل المبيض الأيسر والأيمي من نفس ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أمكن هذا العمل من خلال دعم الهياكل الأساسية التشغيلية لحكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية NHMRC IRIISS وبدعم من تمويل من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (ALW #1120300) ومجلس البحوث الأسترالي (KJH #FT190100265). ويود المؤلفون الاعتراف بالدعم التقني لمنصة موناش لأبحاث الحيوانات ومنصة موناش لعلم الأنسجة ومنشأة موناش للتصوير الدقيق.
Materials
| 1-Butanol (HPLC) | Fisher Chemical | #A383-1 | |
| Acid alcohol | Amber Scientific | #ACDL | |
| Bouin’s fixative | Sigma-Aldrich | #HT10132 | Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v) |
| Cyclophosphamide | Sigma-Aldrich | #C0768-5G | |
| Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX) | Sigma-Aldrich | #06522 | |
| Ethanol | Amber Scientific | #ETH | Ethanol 100% |
| Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle | Designs for Vision | #FEA-745-SR | Feather blade for dissections (seen in Figure 1) |
| Formalin fixative | Australian Biostain | #ANBFC | |
| Glass coverslip | Thermo Scientific | #MENCS22501GP | 22 mm x 50 mm |
| Glycomethacrylate resin RM2165 microtome | Leica Microsystems | #RM2165 | |
| Glycolmethacrylate DPX | *made in house | *Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks | |
| Histolene | Trajan | #11031 | |
| Mayer’s haematoxylin | Amber Scientific | #MH | |
| Olympus BX50 microscope | Olympus | #BX50 | Brightfield microscope fitted with 10x dry & 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3) |
| Olympus immersion oil type-F | Olympus | #IMMOIL-F30CC | |
| Olympus TH4-200 light source | Olympus | #TH4-200 | |
| Paraffin wax | Sigma-Aldrich | #03987 | |
| Periodic acid | Trajan | #PERI1% | Periodic acid 1% |
| Rotary Microtome CUT 4060 | MicroTec | #4060R/F | Used to cut paraffin sections |
| Schiff’s reagent | Trajan | #SCHF | |
| Scott's tap water | Amber Scientific | #SCOT | Potassium carbonate, magnesium sulphate, water |
| StereoInvestigator Stereological System | MBF Bioscience | Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick | |
| Superfrost microscope slides | Thermo Scientific | #MENSF41296SP | 1 mm, 72 pcs |
| Technovit 7100 Plastic embedding system | Emgrid Australia | #64709003 | 500 mL/5 x 1 g/40 mL |
| Technovit 3040 yellow | Emgrid Australia | #64708805 | 100 g/80 mL |
References
- Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. The capacity of oocytes for DNA repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications. Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- Ristic, N., et al. Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring. Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).
- Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).
- Brown, D. L. Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology. Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).
- Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design. Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts–not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Nguyen, Q. N., et al. Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility. Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).
- Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice. Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).
- Winship, A. L., et al. The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation. Human Reproduction. , (2020).
- Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool. Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).
- Nguyen, Q. N., et al. Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes. Molecular Human Reproduction. , (2019).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).
- Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).
- Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established. Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).
- Omari, S., et al. Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve. Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).
- Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age. Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary. Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).
- Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age. Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).
- Charleston, J. S., et al. Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem. Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).
- Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
- Hansen, K. R., et al. A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause. Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).
- Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).
- McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger. Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).
- Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).
