Summary

Transuterine Fetal Tracheal Okklusion Modell bei Mäusen

Published: February 05, 2021
doi:

Summary

Verschiedene Tiermodelle der angeborenen zwerchmatischen Hernie und fetalen Trachealverschluss stellen Vor- und Nachteile in Bezug auf ethische Fragen, Kosten, chirurgische Schwierigkeiten, Größe, Überlebensraten und Verfügbarkeit genetischer Werkzeuge dar. Dieses Modell bietet ein neues Werkzeug, um die Auswirkungen von Trachealokklusion und erhöhtem Luminaldruck auf die Lungenentwicklung zu untersuchen.

Abstract

Fetale Trachealverschluss (TO), eine etablierte Behandlungsmodalität, fördert das fetale Lungenwachstum und das Überleben bei schwerer angeborener Zwerchfellhernie (CDH). Nach TO erhöht die Retention der abgesonderten Epithelflüssigkeit den Luminaldruck und induziert Lungenwachstum. Verschiedene Tiermodelle wurden definiert, um die Pathophysiologie von CDH und TO zu verstehen. Alle haben ihre eigenen Vor- und Nachteile wie die Schwierigkeit der Technik, die Größe des Tieres, die Kosten, die hohen Sterblichkeitsraten und die Verfügbarkeit genetischer Werkzeuge. Hierin wird ein neuartiges transuterines Modell des murinen fetalen TO beschrieben. Schwangere Mäuse wurden anästhesisiert und die Gebärmutter über eine Mittellinien-Laparotomie exponiert. Die Luftröhre ausgewählter Föten wurde mit einer einzigen transuteren Naht hinter der Luftröhre, einer Karotisarterie und einer jugularen Vene ligiert. Der Damm wurde geschlossen und konnte sich erholen. Fetusen wurden kurz vor der Teilnahme gesammelt. Lungen-Körper-Gewicht-Verhältnis bei To Föten war höher als bei der Kontrolle Föten. Dieses Modell bietet Forschern ein neues Werkzeug, um die Auswirkungen von TO und erhöhtem Luminaldruck auf die Lungenentwicklung zu untersuchen.

Introduction

Angeborene Zwerchfellhernie (CDH) tritt in 1:2500 Schwangerschaften auf und führt zu pulmonaler Hypoplasie und neonataler pulmonaler Hypertonie1,2,3,4,5,6. Fetale Trachealverschluss (TO) ist eine etablierte pränatale Therapie bei schweren CDH-Patienten mit Fetoskopie in der 26-30. Schwangerschaftswoche, in der ein Ballon knapp über der Karina platziert und dann in der32. Schwangerschaftswoche entfernt wird. Diese vorübergehende TO induziert fetales Lungenwachstum und verbessert das Überleben. Das angeborene High Airway Obstruction Syndrom ist eine tödliche Erkrankung im Zusammenhang mit Lungenhyperplasie, die Chirurgen dazu inspirierte, künstliche Okklusion der Luftröhre durchzuführen, um die Retention der abgesonderten Epithelflüssigkeit zu fördern. Diese Okklusion erhöhte den Luminaldruck und induzierte Lungenwachstum7. Die Okklusion sollte jedoch umgekehrt werden, um die Epithelzellreifung zu ermöglichen.

Verschiedene Tiermodelle von CDH und TO – Schafe, Kaninchen, Ratten und Mäuse – wurden entwickelt, um die Pathophysiologie von CDH und TO zu verstehen. Alle haben ihre eigenen Vor- und Nachteile wie die Schwierigkeit der Technik, die Größe des Tieres, die Kosten, die hohen Sterblichkeitsraten und die Verfügbarkeit genetischer Werkzeuge. Obwohl die chirurgische Technik, die für das Schafmodell verwendet wird, der beim Menschen verwendeten sehr ähnlich ist und umgekehrt werden könnte, sind die Hauptnachteile dieses Modells die Kosten des Tieres, die lange Schwangerschaftszeit und die begrenzte Anzahl von Operationen möglich. Das Kaninchenmodell hat eine kürzere Trächtigkeitszeit und ist kostengünstiger als das Schafmodell. Das Kaninchenmodell ist jedoch irreversibel8,9. Das murine Modell hat die niedrigsten Kosten, die höchste Anzahl von Föten pro Schwangerschaft, das am besten charakterisierte Genom und weit verbreitete Werkzeuge für zelluläre und molekulare Analysen. Ein wesentlicher Nachteil ist jedoch die fehlende Reversibilität des TO, wodurch ein vollständiges Verständnis der Auswirkungen von TO verhindert wird. Hierin wird eine Methode vorgestellt, die alle Vorteile der oben genannten Modelle vereint und ein einfaches, potenziell reversibles und minimalinvasives Nagetier-TO-Modell schafft.

Protocol

Alle Experimente entsprechen dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80023, revidiert 1978). Das Verfahren wurde mit dem IACUC-Protokoll #2016-0068 vom Ausschuss für institutionelle Tierpflege und -nutzung der Cincinnati Children es Research Foundation genehmigt. 1. Vorbereitung Um altersgerechte Wildtyp (WT) C57BL/6 Mäuse zu paaren, legen Sie sie um 18:00 uhr .m. in denselben Käfig und trennen Sie sie am nächsten T…

Representative Results

Diese Studie untersuchte 37 Föten: 20 (54,1%) wie TO vs. 17 (45,9%) als Kontrolle. Da die Luftröhre nicht in 4 Föten der TO-Gruppe verfeinert werden konnte, wurden sie von der Studie ausgeschlossen. In beiden Gruppen gab es keinen signifikanten Unterschied in der Sterblichkeit: 4 Föten (25%) in der TO-Gruppe und 2 Föten (12%) in der Kontrollgruppe (p=0,334, Odds Ratio (OR) 2,5, 95% Konfidenzintervall (CI) 0,39-16,05). Das mittlere Körpergewicht, das Lungengewicht und das Verhältnis…

Discussion

Diese Methode beschreibt einen chirurgischen Eingriff der fetalen Trachealverschlussbeiklusion bei Mäusen und seine Auswirkungen auf die Lungenentwicklung. Es gibt einige wichtige Schritte im Protokoll, die sorgfältig ausgeführt werden sollten, um erfolgreicheTO durchzuführen. Die Wärme der Plattform, auf der die Operation stattfindet und die in die Peritonealhöhle eingeführte Saline ist entscheidend für das Fortschreiten der Schwangerschaft. Darüber hinaus muss ein leichter Druck auf den Kopf der Welpen ausgeü…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung erhielt keine spezifischen Zuschüsse von Förderstellen in den Bereichen öffentliche, kommerzielle oder gemeinnützige Zwecke. Alle Autoren haben wesentliche Beiträge zur Konzeption und Gestaltung der Studie, des Erwerbs, der Analyse und der Interpretation von Daten geleistet, den Artikel verfasst und für wichtige intellektuelle Inhalte und die endgültige Genehmigung der einzureichenden Fassung überarbeitet. Die Autoren danken Can Sabuncuo-lu für seine freundlichen Bemühungen bei der Herstellung des Kunstwerks der chirurgischen Technik.

Materials

Buprenorphine  Par Pharmaceutical NDC 42023-179-05 For regional anesthesia
Isoflurane   Halocarbon Life Sciences NDC 66794-017-25 For general anesthesia
Magnification glasses USA Medical-Surgical SLR-250LBLK At least 2.5x
Nikon 90i microscope Nikon 3417 Motorized Fluorescence
Nucleospin Tissue Kit  Macherey-Nagel, Düren, Germany 740952.5 DNA isolation
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher, IL, USA 23225 Protein quantification
Polyglactin suture Ethicon VCP451H 4-0, 24 mm, cutting
Polylysine slides  VWR  48382-117 Microscope adhesion slides
Polypropylene suture Ethicon Y432H 6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint
RIPA buffer  Sigma-Aldrich, Missouri, USA R0278-50ml Protein isolation
Silk suture Ethicon VCP682G 4-0, 24 mm, cutting
Trizol  Invitrogen  15596026 RNA isolation

References

  1. Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452 (2019).
  2. Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
  3. Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
  4. Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
  5. Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
  6. Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
  7. Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
  8. Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
  9. Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
  10. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  11. Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
  12. Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).

Play Video

Cite This Article
Aydın, E., Joshi, R., Oria, M., Lim, F., Varisco, B. M., Peiro, J. L. Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice. J. Vis. Exp. (168), e61772, doi:10.3791/61772 (2021).

View Video