纳米材料获得的蛋白质和代谢物科罗纳的毛细电电量谱方法

根据莱顿大学和因斯布鲁克医科大学的IRB协议指南，人类生物流的使用得到批准。在调查人类或动物生物流体时，需要获得研究机构的伦理批准，并且已获得本协议中所示的结果。此外，亦应进行适当的报告，以确保数据在未来的工作9、29、30的透明度和可重复性。 1. 背景电解质的制备 注：所有溶剂应在合适的烟气罩中准备，所有步骤（实验室涂料、手套和护目镜）都必须使用足够的个人防护设备。在每一步中，都需要低结合塑料瓶，以尽量减少从玻璃器皿中浸出的盐对样品的分析损失和污染。 每天准备 10% 醋酸 BGE （v/v），pH 2.2 用于代谢学。 进入10mL体积的烧瓶中加入1mL的醋酸，然后在标记的生产线上加入去离子（DI）水并彻底混合。 准备100mM醋酸，pH 2.9每天的基础上，为蛋白真学。 进入10mL体积的烧瓶中加入57微升醋酸，然后加入DI水到标记线和彻底混合。 2. NM 准备 使用已发布的指南31、32、33大力分散水中的NM。注：在制定本协议时，使用了7个NM，分别是100和1000纳米碳基聚苯乙烯用于蛋白质和代谢物日冕。100 nm 未修改的聚苯乙烯 NMs，13 nm anatase TiO2 NM 未修改或涂有聚丙烯酸酯或 PVP 聚合物，22 nm 未修改 SiO2 Nms 用于蛋白质和代谢物日冕。虽然该方法是使用这些 NM 开发和演示的，但应该指出，这种方法将适用于各种 NM 成分、大小、形状和形态。 使用动态光散射34、35、单粒子电感耦合等离子质谱36、纳米粒子跟踪分析37，或利用zeta sizer34传输电子显微镜和表面电荷作为zeta电位，描述粒子大小。 3. 生物分子日冕形成 将2mL的人类血浆（或选择的生物流体）分成1兆瓦，一个用于代谢物和蛋白质日冕，第二个用于等离子体代谢物的表征。 在 37 °C 下在人体等离子体中孵育 1 毫克/毫升的 NM，同时在热混合器中以 500 rpm 轻轻混合。孵化后离心机样品在 4，000 x g 15 分钟在 4 °C 颗粒 Nms. 收集等离子体超高纳剂进行代谢物日冕分析。保留 NM 蛋白日冕复合物，用于蛋白质日冕表征。 4. 蛋白质日冕分离 将 NM 蛋白复合物（颗粒）在 1 mL 的 10 倍 PBS 缓冲器和漩涡中大力重复 2 分钟，以去除未绑定的蛋白质。将 PBS 溶液在 4，000 x g 下离心，在 4 °C 下 15 分钟将 NM 颗粒化，并小心地取出超高颗粒，而不会干扰颗粒。 将颗粒以 1 mL 的碳酸氢铵缓冲器 （ABC） （100 mM， pH 8.0） 和漩涡强烈地重复 2 分钟，以去除未受约束的蛋白质和不受欢迎的盐。离心机在 4，000 x g 15 分钟在 4 °C 颗粒 Nms;取出并丢弃超高等。重复此步骤。 通过溶解含有 10 mM 二乙醚的 ABC 缓冲器 （100 mM pH 8） 中的 NM 蛋白颗粒，减少蛋白质脱硫键。在 56 °C 下将减少解决方案孵化 30 分钟。 要消化蛋白质，请添加 2 μg 的测序级 Trypsin 到 20 μL 的 ABC 含有 0.1% 表面活性剂。在 37 °C 下将消化液孵化 16 小时。 在 100 mM ABC 中加入 55 mM 的 20 微升碘酰胺，并在室温下孵育 20 分钟，从而对样品进行碱化。 加入 20 μL 的 0.1 M HCl 以切割表面活性剂，并在室温下离开 10 分钟。 使用 C18 包装脱盐移液器尖端丰富和脱盐肽。 用 80 μL 0.1% 的甲酸 50% 丙酮三聚醇润滑尖端 5 次， 用 80 μL 0.1% 的甲酸清洗 5 次，绘制和提取样品 10 次，通过冲洗 80 μL 0.1% 的甲酸 5 次，用 80 μL 0.1% 的甲基苯丙酸将样品提取到干净的低结合 PCR 管中。 将样品放样并储存在 -20 °C，直到分析。 5. 代谢物日冕分离 从第 3.3 步从 NM 等离子体孵化中取出控制等离子体和超高纳特，并在样品准备过程中保持冰上。 将每个瓶中的 50 μL 放入单独的瓶中，用 DI 水稀释十中 1。取每个稀释样品的 50 μL，然后移动到新的小瓶进行第 5.3 步。 加入 200 μL 氯仿、250 μL 甲醇和 350 μL DI 水，大力涡流混合物 2 分钟。离心机 10 分钟，在 4 °C 下 20，800 x g。 服用 500 μL 超高超纳坦，在 4 °C 下通过 3 kDa 离心过滤器过滤 2 小时，10，000 x g。 服用 430 μL 的超滤和干燥的速度真空。样品现在可以在分析前冻结。 6. 编制CESI-MS系统38 注：在安装毛细血管之前，请检查毛细血管的入口和出口端是否完好无损，毛细血管中是否存在可见的破损。 安装中性涂层毛细细丝蛋白质日冕分析39。 按照制造商指南，将新的中性涂层毛细细圈（90 厘米长，内部直径为 30 μm）放入 CESI 仪器中。 准备 CESI 毛细血管进行蛋白化分析。 在 100 psi 下使用 100 mM 的 HCl 朝前方方向冲洗分离毛细管 5 分钟，并在毛细管出口处检查水滴形成。冲洗分离毛细管与 BGE 在 100 psi 10 分钟，然后 DI 水在 100 psi 为 30 分钟（这只需要新的毛细血管）。 将分离毛细管和导电毛细管与 BGE 在 90 psi 下冲洗 5 分钟，并确保两个毛细血管出口端形成液滴。 用 DI 水在 90 psi 下冲洗分离毛细管 10 分钟，然后用 0.1 M HCl 冲洗 50 psi 10 分钟，然后用 DI 水冲洗 90 psi 10 分钟，最后用 90 psi 冲洗 10 分钟。将CESI与MS结合使用纳米喷雾源和适配器，如前所述38。 安装裸熔二氧化硅毛细细用于代谢物日冕特征38。 按照制造商的指导原则，将新的裸熔硅毛细细（90 厘米长，内部直径为 30μm）放入 CESI 仪器中。 为代谢分析准备 CESI 毛细血管。 在 50 psi 下使用 100% MeOH 朝前方方向冲洗分离毛细管 15 分钟，并在毛细管出口处检查水滴形成。将分离毛细管和导电毛细管与 BGE 在 90 psi 下冲洗 5 分钟，并确保两个毛细血管出口处形成液滴。 用 DI 水在 90 psi 下冲洗分离毛细管 10 分钟，然后用 0.1 M NaOH 冲洗 50 psi 10 分钟，然后用 DI 水冲洗 90 psi 10 分钟，最后用 90 psi 冲洗 10 分钟 BGE。使用之前描述的纳米喷雾源和适配器将 CESI 与 ESI-MS 耦合。38 7. 用于蛋白质日冕分析的 CE-MS 从步骤 4.8 中重新恢复样品，在 20 μL 的 50 mM 醋酸铵 pH 4.0 中。 执行 5 psi 10s 流体动力学样品注射。使用 30 kV 分离电压与以下压力梯度分开：1 psi 0-10 分钟，1.5 psi 10-35 分钟，5 psi 使用 100 mM、pH 2.9 醋酸作为 BGE 35-45 分钟。 收集 250-2000 m/z 之间的质谱，并获取前 10 名数据依赖性碎片采集。 在样品之间，用0.1 M HCl冲洗毛细管，3分钟100 psi，10分钟100 psi BGE分离毛细管，3分钟100 psi用于导电液毛细管。 8. 用于代谢物日冕分析的 CESI-MS 注：所有样品必须分析两次，一次为正模式检测阴离子，一次为阴性模式检测阴离子。控制等离子体样品至少需要分析5次。 在 430 μL 的 DI 水中从第 5.4 步中重新使用 NM 暴露和未暴露的等离子体样本，并大力涡流 2 分钟。通过 0.1 μm 膜过滤器过滤。 服用 95 μL 的过滤液，在 200 μM 的阴离子（L-甲氨基硫酮）和 400 μM 的离子（2，2，4，4，4-D4-柠檬酸）和涡流中加入 5 μL 的内部标准。在 CESI-MS 分析之前，在 4°C 下 4，000 x g 的离心机 10 分钟。 在 2 psi 下以水动力学注射样品，用于 30s（cations）和 40s（离子）。 在10%醋酸中分离代谢物，在前进（离子）和反向（离子）模式下分离电压为30千伏。反向分离模式辅助分离毛细管的 0.5 psi 向前压力。 设置质谱仪，以正（离子）或负（离子）模式收集质量范围为 65-1000 m/z 的数据。 在样品之间，用 0.1 M HCl、0.1 M NaOH、DI 水和 BGE 在 50 psi 冲洗毛细管 2 分钟。