懸濁液中の金ナノ粒子のサイズに対する非対称流量場流分画

1. AF4システムのセットアップ 製造元のマニュアルに記載されている指示に従って、AF4カートリッジを組み立て、AF4システムとUV-vis検出器(材料表)のすべてのハードウェアコンポーネントを接続します。 メーカーのマニュアルに記載されている指示に従って、制御、データ収集、処理、評価に必要なすべてのソフトウェアパッケージをインストールします。 AF4システムとUV-vis検出器の間に必要な信号接続がすべて確立されていることを確認します。 確立されたAF4-UV-vis接続が15分間の超純水(UPW)でセットアップを流すことによって、密着性と漏れがないことを確認してください(チップフローレート1 mL∙min-1、フォーカス流量1mの∙min-1、クロスフローレート1.5 mL min-1)。これを行うには、AF4 コントロール ソフトウェアを開き、ランディング ページの右上にあるそれぞれのパネルに流量を入力します。必要に応じて、それぞれのコネクタ(継手)を締め、漏れが発生しなくなるまで手順を繰り返します。注: すべての測定中の内部システム圧力は監視する必要があり、4 から 12 のバーの範囲内になければなりません。圧力が高いか低い場合は、背圧チューブを調整する必要があります。さらに、チャネル圧力の傾向は、完全な測定時間にわたって一定である必要があります。注:チャネルオーブンが利用可能な場合は、すべてのAF4実験を通して同等の測定条件を確保するために、その温度を25°Cに設定してください。 2. AF4-UV-visシステムの認定およびサンプル分析のためのソリューションとサスペンションの調製 洗浄液 8gの水酸化ナトリウム(NaOH)と2gのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を1LのUPWに加え、完全に溶解するまで溶液をかき混ぜる。 溶 離 液 500 μLの濾過された界面活性剤混合物を2 Lの濾過および脱ガスされたUPWに加え、溶出液(0.025%(v/v)、pHを9.4の周りに得る。注: 界面活性剤混合物の化合物の詳細な説明は、表1(表の材料も含む)に示されています。 大量回収測定のための任意のAuNPサイズ標準 ボルテックスは、任意のAuNPサイズ標準(50mg∙L-1)を2分間、UPWで1:4希釈して12.5mg∙L-1の最終質量濃度を得る。渦は、希釈後2分間、得られた懸濁液を均質化する。注意:化学物質、特にNaOHペレットを扱う場合は、必要な予防措置と適切な保護具が必要です。注:AF4-UV-vis-実験中に低粒子の背景を確保するために、0.1 μmの膜フィルター(親水性PVDFまたは類似)を使用して、必要なすべての溶液(洗浄液を除く)を脱ガスおよびフィルタリングすることが一般的に推奨されます。これは、専用の真空ろ過ユニットまたはシリンジフィルターを使用して確立することができます。 3. AF4-UV-visシステムの資格 ステップ 1.4 で説明したソフトウェア設定を使用して、システムを 30 分間の洗浄液で洗い流します (チップ流量 1 mL∙min-1、フォーカス流量 1 mL∙min-1、およびクロス流量 1.5 mL∙分-1)。 それぞれの溶出ボトルを変更し、20分間UPWでシステムをフラッシュします(チップ流量1 mL∙min-1、フォーカス流量1mL∙min-1、およびクロス流量1.5 mL∙分-1)。 それぞれのインラインポンプフィルタを交換してください。 AF4カートリッジを開き、AF4膜を交換してください。AF4カートリッジを再組み立て、AF4-UV-visシステムに再接続します。 洗浄したAF4-UV-visシステムを、膜を平衡化してシステムを安定化させるために、少なくとも30分間溶出して洗浄したAF4-UV-visシステムをフラッシュします(先端流量1 mL∙min-1、フォーカス流量1mの∙min-1、クロス流量1.5mL分-1)。漏れの可能性を再度確認します(ステップ1.4を参照)。 任意のAuNPサイズ規格を使用して、質量回収と保持時間の変動を決定することにより、AF4-UV-visシステムを修飾します。 分離力を適用せずに直接注入を実行します。 [ファイル] |を開いて新しい測定 ファイルを作成する新しい| AF4制御ソフトウェアで実行します。 サンプルと測定の説明、射出量とサンプル名を [実行 ]タブで定義します。測定条件は 表 2に表示されます。 表 2に従って、2 番目のタブFFF メソッドで測定パラメータを設定します。 [ 実行 ]ボタンをクリックして、測定を開始します。 分離力(クロスフロー)の適用で分数を実行します。 表 3で指定した分数条件を使用して、前のセクションで説明した分数法を定義します。 [ 実行 ]ボタンをクリックして、測定を開始します。 測定を4倍にして行います。注:最初の実行は、システム(すなわち、AF4膜)のコンディショニングを目的とし、システム資格の最終評価から除外されます。注: ファイル |を開いて、生成されたすべての実行ファイル を 保存することをお勧めしますAF4制御ソフトウェアで 保存 します。 任意の AuNP サイズ標準に対して 、>80% の質量回復と保持時間の変動 <2% が得られる場合は、AF4-UV-vis-システムの修飾を検討してください。 オートサンプラーを注入システムとして使用する場合は、オートサンプラーの針洗浄リザーバーボトルに、AF4-UV-visシステムを介してポンプで送り込まれるのと同じ溶液(例えば、洗浄液、UPW、またはそれぞれの溶片)を充填して、最適な走行条件を確保します。溶出性を変化させる場合、一般的に、そのベースラインが一定のレベルで安定するまでUV-vis-detector信号を監視することによって、AF4系の再平衡化に従うことを推奨する。 4. AF4-UV-vis サンプル解析 それぞれのAuNP懸濁液(20nm、40 nm、80 nm、100 nm、各50mg)をボルテックスすることにより、外部サイズキャリブレーションのすべてのAuNPサイズ標準を準備します。L-1)を2分間にし、UPWで1:4に希釈して、最終的な質量濃度12.5 mg∙L-1を得る。得られた懸濁液を均質化するために希釈後2分間のボルテックスを追加する。 ステップ 4.1 で説明した校正標準と同じ手順を適用して、未知の AuNP サンプルを分析用に準備します。 表2に示したAF4法を用いて、全てのAuNPサイズ規格の直接注入測定を行う。 これを行うには、 表 2 に要約したそれぞれの値を製造元のソフトウェアに適切な位置に入力して、分離パラメータとサンプル パラメータを定義し、[ 実行 ]ボタンを押して実験を開始します。 表3に表示されているAF4方式を用いて、各AuNPサイズ標準を個別に分数し、外部サイズ調整機能を確立する。 表 3に要約したそれぞれの値を、製造元のソフトウェアの適切な位置に入力します。分数法は、焦点合わせステップ、いくつかの溶出ステップ、およびリンスステップによって定義される。メソッドを設定したら、実行ボタンを押して実験を開始します。 表2に表示されているAF4法を用いて未知のAuNPサンプルの直接注入測定を行う。 表3に示したAF4法を実施して未知のAuNPサンプルの分画を行う。 意味のある統計的に関連する結果を確実にするために特に明記されていない限り、 セクション3 および 4 に記載されているすべての測定を三重に実行する。 50 mg の∙L-1 AuNP の在庫の使用前に 4 – 8 °C で保管してください。希釈されたAuNP懸濁液は、塗布前に30分以内に理想的に調製されます。注:ボルテックスは通常十分であり、懸濁液の超音波は必要ありません。 未知のAuNPサンプルの保持時間と、AuNPサイズ規格で得られた保持時間との相関を可能にするために、同じAF4法を用いてすべてのサンプルを測定する。注: 一定の有効な分離条件を保証するには、サンプル測定の定義された数(例えば、10回の測定)の後に、システムの認定セクションで説明されている分数ステップを含める/繰り返します(ステップ3.6.2を参照)。さらに、記録システム圧力およびUV-vis検出器のベースライン安定性。それらは完全なAF4-UV-visの実行に沿って安定し、一定であるべきである。注: 通常、UV-vis 検出器(またはマルチアングル光散乱(MALS)検出器がノイズレベルの増加を示す場合、または回復、サンプルピーク形状、または再現性などの定義されたシステムの認定基準が見つからない場合(または AF4-UV-vis-system が徹底的な洗浄手順を行った場合)、限外濾過膜を交換します。ここで説明する条件下では、修飾されたAF4-UV-visシステムは、通常、同じ膜を使用して少なくとも50の測定のために安定しています。ただし、定義された品質基準を満たす連続測定の数は、サンプル、サンプルマトリックス、および溶出性の組成によって大きく異なる場合があります。 5. データ評価 AF4-UV-visシステムメーカーが提供するデータ評価ソフトウェアを使用して、またはメーカーのマニュアルに記載されている指示に従って、それぞれのデータ取得ソフトウェアから必要なすべての生データ(すなわち、UV-visピーク領域)をエクスポートした後のスプレッドシート分析のいずれかを使用して、質量回収計算を実行します。 次の式を使用して、分別測定の各 UV-vis ピークの下の領域 (分別) と直接射出測定 (A直接注入) を比較して、AuNP 質量回復を計算します。注: 直接注入の測定中は、分離力は適用されないため、分析対象種と蓄積壁との相互作用の可能性は無視される可能性があります。それぞれのUV-visピークの下の面積は、サンプル内の他の種がそれぞれの波長で吸収しないか、および/またはi)分別条件ii)で別の保持時間でエルトがAF4膜を介して除去されると仮定して、ビール・ランバート法を使用してAuNP質量に直接相関させることができる。 直接注入と分数の実行の両方から取得した dat. ファイルをインポートします。 [概要]タブで UV-vis 検出器トレースを選択します。 すべての測定値の信号とベースラインビューで、対象領域(ROI)とベースラインを定義します。 挿入を使用して直接射出キャリブレーションを挿入します。 [直接射出 キャリブレーション設定]ビューですべての直接射出 実行を選択し、UV の消光係数を入力します。注: キャリブレーションと分数測定の両方に同じ UV-vis の消滅係数を使用することが重要です。 ROI 内の UV-vis 信号トレースの下の領域と、入力された濃度と注入量から計算された注入量を使用して、キャリブレーションラインを確立します。取得したキャリブレーションは、別の 直接注入キャリブレーション機能 ウィンドウに表示されます。 キャリブレーション関数をそれぞれの分数測定に割り当てます。注: キャリブレーションサイズ標準と未知の AuNP サンプルごとに、AuNP のサイズに依存する UV-vis 吸光度により、個別のキャリブレーション機能を確立する必要があります。このUV-vis検出器の欠点は、ICP-MSなどの質量感応検出器を用いて回避することができる。 定量結果計算を挿入して分析を実行すると、結果は右のテーブル内に濃度と注入量の値として表示されます。 AF4システムメーカーが提供するデータ評価ソフトウェアまたはスプレッドシート分析を使用して、製造元のマニュアルに記載されている指示に従って、それぞれのデータ取得ソフトウェアから、必要なすべての生データ(すなわち、それぞれのUV-visピークマキシマおよびそれぞれのボイド時間でのAuNPキャリブレーション基準の保持時間)を使用して、保持時間の変動を計算します。 [概要]ウィンドウを開き、読み込まれたすべての計測値に対応する UV トレースを表示します。 ピーク検出は自動的に実行されます。パフォーマンスを最適化するために、信号処理ツールボックス内のピーク検出パラメータを調整します。すべての測定ファイルを通過して、それぞれのピークマキシマを抽出します。 次の式を使用して、すべての測定値の相対標準偏差を計算します。計算は、それぞれのスプレッドシートソフトウェアを使用して実行することもできます。 メーカーのマニュアルに記載されている指示に従って、各データ取得ソフトウェアから必要なすべての生データ(UV-visピーク最大分析対象および各ボイドタイム)をエクスポートした後、メーカーが提供するデータ評価ソフトウェアまたはスプレッドシート分析を使用して、サイズ決定を行います。外部サイズキャリブレーション機能は、以前に実行されたDLS測定から得られた流体力学的サイズに対して、AuNPサイズ標準(20nm、40nm、80 nm、100nm)のボイド時間補正保持時間(正味保持時間、 表5を参照)をプロットすることによって確立することができる( 表4参照)。注: DLS 測定は、類似したサンプルプロパティを確保するために、それぞれの分画測定と同じ日に理想的に行う必要があります。 .datファイルをインポートすると、すべての測定値が [概要 ]タブに表示されます。オーバーレイ・ウィンドウの下に表示される検出器リストから UV-vis 検出器信号を選択します。各測定値の ROI とベースラインを定義し、 信号とベースライン ビューで調整できます。右側の [信号処理 ]ツールボックスを使用して、騒がしい信号を滑らかにしてください。 処理パラメータを他の実行に割り当てる 関数を使用すると、パラメータを他の計測値にそれぞれ割り当てることができます。 [挿入]タブから[パーティクル サイズの調整]を選択します。 右上の「キャリブレーション用の参照を選択」テーブルでそれぞれの測定値をクリックして 、すべてのキャリブレーション 実行を選択します。選択したすべての測定値が下の表に表示されます。 表 4に指定されているすべてのキャリブレーション測定の流体力学半径を入力します。関数は、パーティクルサイズのキャリブレーション – 関数ウィンドウに表示され、式も表示されます。注: 確立されたサイズ調整関数の相関係数 (R2)は、≥0.990 でなければなりません。 [割り当て実行の選択]リスト内のそれぞれの分数を選択して、未知のAuNPサンプルの測定値にキャリブレーション機能 を割り当てます 。 [挿入]タブでパーティクル サイズ分布の計算を開いて結果を表示します。以前に作成した粒子サイズのキャリブレーションは、未知のAuNPサンプル測定のキャリブレーションとしてリストされ、右のウィンドウ設定に表示されます。計算されたサイズは、最大ピークにラベル付けされたサイズ分布ウィンドウに表示されます。「サンプルの平均信号」チェックボックスを選択すると、1つのサンプルのすべての測定値を平均化し、結果をピークの最大ラベルにリスト表示します。 さらに、[キャリブレーション カーブを表示 ]チェックボックスを選択して、フラクトグラム上にキャリブレーションラインをプロットします。累積サイズ分布は、[ 累積分布を表示 ]チェックボックスを選択して利用できます。注: データ評価のために製造元のソフトウェアを使用する場合は、すべての結果をレポートに追加することをお勧めします。 [レポート] ボタンをクリックすると、すべての結果、表、および図表がドキュメントに追加されます。[レポート] タブで、[ドキュメント] セクションで[レポート設定]を開いて、レポートの設定を変更できます。