JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

שבר זרימה א-סימטרי שדה זרימה לשינוי גודל של חלקיקי זהב בהשעיה

Published: September 11, 2020
doi:
10.3791/61757
, , , ,
1Research & Development,Postnova Analytics GmbH

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשבר שדה זרימה-זרימה אסימטרי בשילוב עם זיהוי UV-vis לקביעת הגודל של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע.

Abstract

גודל החלקיקים הוא ללא ספק הפרמטר הפיזיקו-כימי החשוב ביותר הקשור לרעיון של חלקיק. ידע מדויק של התפלגות גודל וגודל של חלקיקים הוא בעל חשיבות עליונה עבור יישומים שונים. טווח הגודל חשוב גם, שכן הוא מגדיר את המרכיב “הפעיל” ביותר של מינון ננו-חלקיקים.

שבר זרימת זרימה אסימטרי (AF4) היא טכניקה רבת עוצמה לשינוי גודל של חלקיקים בהשעיה בטווח הגודל של כ 1-1000 ננומטר. קיימות מספר דרכים להפיק מידע גודל מניסוי AF4. מלבד צימוד AF4 באינטרנט עם גלאים רגישים לגודל המבוססים על העקרונות של פיזור אור רב זוויתי או פיזור אור דינמי, יש גם את האפשרות לתאם את הגודל של מדגם עם זמן השמירה שלה באמצעות גישה תיאורטית מבוססת היטב (תאוריית FFF) או על ידי השוואתו עם זמני השמירה של תקני גודל חלקיקים מוגדרים היטב (כיול גודל חיצוני).

אנו מתארים כאן את הפיתוח ואת האימות בתוך הארגון של הליך פעולה סטנדרטי (SOP) לשינוי גודל של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע על ידי AF4 בשילוב עם זיהוי UV-vis באמצעות כיול גודל חיצוני עם תקני חלקיקי זהב בטווח הגודל של 20-100 ננומטר. הליך זה מספק תיאור מפורט של זרימת העבודה שפותחה כולל הכנת מדגם, הגדרת מכשיר AF4 והסמכה, פיתוח שיטת AF4 ושבר של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע, כמו גם את המתאם של התוצאות שהתקבלו עם כיול גודל חיצוני הוקמה. ה- SOP המתואר כאן אומת בסופו של דבר בהצלחה במסגרת מחקר השוואה interlaboratory המדגיש את החוסן והאמינות המצוינים של AF4 לשינוי גודל של דגימות ננו-חלקיקים בהשעיה.

Introduction

חלקיקי זהב (AuNP) בצורה של זהב קולואידי היו חלק מתרבות האדם הרבה לפני שהייתה הבנה של מה הם חלקיקים ולפני שהמונח חלקיקים מצאו את דרכם לאוצר מילים מדעי עכשווי. ללא ידע ברור על המראה הננומטרי שלהם, AuNP מושעה כבר שימש למטרות רפואיות ואחרות בסין העתיקה, ערב, והודו במאות V-VI לפני הספירה1, וגם הרומאים העתיקים ניצלו את צבעם האדום האודם כדי להכתים את כלי החרס שלהם בתערוכת גביע Lycurgus במוזיאון הבריטי2. בעולם המערבי, לאורך מאות שנים מימי הביניים ועד העידן המודרני, AuNP מושעה שימשו בעיקר כסוכני צביעה עבור זכוכית ואמייל (סגול של קאסיוס)3, כמו גם לטיפול במגוון מחלות (זהב ראוי לשתייה), במיוחד עגבת4.

עם זאת, כל המחקרים הללו התמקדו בעיקר ביישום של AuNP מושעה וזה היה תלוי מייקל פאראדיי בשנת 1857 כדי להציג את הגישה הרציונלית הראשונה לחקור את היווצרותם, טבעם, כמו גם את המאפיינים שלהם5. למרות פאראדיי כבר היה מודע לכך AuNP אלה חייב להיות ממדים דקה מאוד, זה לא היה עד הפיתוח של מיקרוסקופ אלקטרונים כאשר מידע מפורש על התפלגות הגודל שלהם היה נגיש6,7, בסופו של דבר המאפשר את המתאם בין גודל ומאפיינים אחרים AuNP.

כיום, הודות לסינתזה קלה ופשוטה למדי שלהם, תכונות אופטיות מדהימות (תהודה פלסמון פני השטח), יציבות כימית טובה ובכך רעילות מינורית, כמו גם צדדיות גבוהה שלהם במונחים של גדלים זמינים ושינויים פני השטח, AuNP מצאו יישומים נרחבים בתחומים כגון nanoelectronics8,אבחון 9, טיפול בסרטן10, או משלוח סמים11. ברור, עבור יישומים אלה, ידע מדויק של התפלגות גודל וגודל של AuNP להחיל הוא תנאי מוקדם בסיסי כדי להבטיח יעילות אופטימלית12 ויש ביקוש משמעותי עבור כלים חזקים ואמינים כדי לקבוע את הפרמטר הזה physico-כימי מכריע. היום, יש שפע של טכניקות אנליטיות המסוגלות לשנות את גודל AuNP בהשעיה כולל, לדוגמה, ספקטרוסקופיית UV-vis (UV-vis)13, פיזור אור דינמי (DLS)14 או ספקטרומטריית מסה פלזמה משולבת UV-vis (spICP-MS)15 עם שבר זרימת שדה (FFF) להיות שחקן מפתח בתחום זה16,17,18,19,20.

הומשג לראשונה בשנת 1966 על ידי J. קלווין גידינגס21, FFF כולל משפחה של טכניקות שבר מבוסס elution, שבו ההפרדה מתרחשת בתוך ערוץ דק, כמו סרט ללא שלב נייח22,23. ב- FFF, ההפרדה נגרמת על ידי אינטראקציה של מדגם עם שדה כוח חיצוני הפועל בניצב לכיוון זרימת ערוץ למינאר, שבו המדגם מועבר במורד הזרם בדרך כלל לכיוון גלאים בשורה בהתאמה. בין טכניקות FFF קשורות אלה, שבר שדה זרימה-זרימה אסימטרי (AF4), שבו זרימה שנייה (זרימה צולבת) משמש כשדה הכוח, הפך לסוג המשנה הנפוץ ביותר24. ב- AF4, תחתית הערוץ (קיר הצטברות) מצוידת בקרום סינון אולטרה-סינון הניתן למחצה המסוגל לשמור על הדגימה ובו זמנית לאפשר לזרימת הצלב לעבור דרך הממברנה ולהשאיר את הערוץ דרך שקע נוסף. באמצעות זה, הזרימה הצולבת יכולה לדחוף את המדגם לכיוון קיר ההצטברות ובכך לנטרל את השטף הנגרמת על ידי דיפוזיה (תנועה בראוניאנית). בשיווי משקל וכתוצאה מכך של שטף שדה ופיזור-induced; מרכיבי מדגם קטנים יותר המציגים מקדמי דיפוזיה גבוהים יותר מתיישרים קרוב יותר למרכז התעלה, בעוד מרכיבי מדגם גדולים יותר המציגים מקדמי דיפוזיה נמוכים יותר מאתרים קרוב יותר לקיר ההצטברות. בשל פרופיל הזרימה הפרבולית בתוך הערוץ, מרכיבי מדגם קטנים יותר מועברים אפוא בלמינה המהירה יותר של זרימת התעלה ו elute לפני מרכיבי מדגם גדולים יותר. באמצעות פרמטר שימור FFF ומשוואות מקדם דיפוזיה סטוקס-איינשטיין, זמן ההעלאה, בהתאמה נפח elution, של מדגם AF4 אז יכול להיות מתורגם ישירות לגודל הידרודינמי שלה22. כאן התנהגות elution המתואר מתייחס למצב elution נורמלי והוא תקף בדרך כלל עבור AF4 בתוך טווח גודל החלקיקים בין כ 1-500 ננומטר (לפעמים עד 2000 ננומטר בהתאם למאפייני חלקיקים ופרמטרים שבר) ואילו elution סטריק-hyperlayer מתרחשת בדרך כלל מעל סף גודל זה25.

קיימות שלוש דרכים נפוצות להפקת מידע גודל לאחר ההפרדה על-ידי FFF. מאז FFF הוא מכשיר מודולרי, זה יכול להיות משולב במורד הזרם עם גלאים מרובים כגון גלאי פיזור אור רגישים לגודל המבוססים על העיקרון של פיזור אור רב זוויתי (MALS)26,27, פיזור אור דינמי (DLS)28,29, או אפילו שילוב של שניהם כדי לקבל מידע צורה נוסף30,31. עם זאת, מאז התנהגות השמירה של מדגם בערוץ FFF נשלטת בדרך כלל על ידי כוחות פיזיים מוגדרים היטב, גודל יכול גם להיות מחושב באמצעות גישה מתמטית (תורת FFF), שבו גלאי ריכוז פשוט (למשל, גלאי UV-vis) מספיק כדי להצביע על נוכחות של מדגם eluting32,33.

כאפשרות שלישית, אנו מדווחים כאן על יישום של כיול גודל חיצוני34,35 באמצעות תקני AuNP מוגדרים היטב בטווח הגודל של 20-100 ננומטר לשינוי גודל של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע במתלה באמצעות AF4 בשילוב עם זיהוי UV-vis. מערך ניסיוני פשוט זה נבחר בכוונה כדי לאפשר לכמה שיותר מעבדות להצטרף להשוואה בינלאומית בין-לאומית (ILC), שבוצעה מאוחר יותר במסגרת פרויקט אופק 2020 של האיחוד האירופי ACEnano על סמך הפרוטוקול המוצג כאן.

Protocol

1. הגדרת מערכת AF4 להרכיב את מחסנית AF4 ולחבר את כל רכיבי החומרה של מערכת AF4 ואת גלאי UV-vis(טבלה של חומרים)בעקבות ההוראות שניתנו במדריך של היצרן. התקן את כל חבילות התוכנה הדרושות לבקרה, רכישת נתונים, עיבוד והערכה בהתאם להוראות המופיעות במדריך היצרן. ודא כי כל חיבורי האות הדרושים בין מערכת AF4 לבין גלאי UV-vis הוקמו. ודא כי חיבורי AF4-UV-vis הוקמו הם הדוקים וללא דליפות על ידי שטיפת ההתקנה עם מים אולטרה-דקים (UPW) במשך 15 דקות (קצב זרימת קצה 1mL∙min-1, קצב זרימת מיקוד 1 mL∙min-1 , וקצב זרימה צולבת 1.5 מ”ל ∙min-1). לשם כך, פתח את תוכנת הבקרה של AF4 והזן את קצבי הזרימה ללוחות המתאימים בצד הימני העליון של דף הנחיתה. הדק את המחברים המתאימים (אביזרים), במידת הצורך, וחזור על ההליך עד שלא ניתן יהיה להבחין בדליפות.הערה: יש לפקח על לחץ המערכת הפנימית במהלך כל המדידות ולהיות בטווח של 4 עד 12 בר. במקרה הלחץ הוא גבוה יותר או נמוך יותר, צינורות backpressure צריך להיות מותאם. יתר על כן, מגמת לחץ הערוצים צריכה להיות קבועה לאורך זמן המדידה המלא.הערה: אם תנור ערוץ זמין, הגדר את הטמפרטורה שלו ל-25 °C (60 °F) כדי להבטיח תנאי מדידה דומים לאורך כל הניסויים של AF4. 2. הכנת פתרונות ומתלים להסמכת מערכת AF4-UV-vis וניתוח מדגם פתרון ניקוי הוסיפו 8 גרם נתרן הידרוקסידי מוצק (NaOH) ו-2 גרם נתרן דודקיל סולפט (SDS) ל-1 L של UPW ומערבבים את הפתרון עד לפירוק מוחלט. אלונט (שני) הוסף 500 μL של תערובת פעילי שטח מסוננים ל 2 L של UPW מסונן ופגים כדי להשיג את eluent (0.025% (v / v), pH סביב 9.4).הערה: תיאור מפורט של התרכובות של תערובת פעילי שטח ניתן בטבלה 1 (גם שולחן החומרים). תקן גודל AuNP שרירותי לקביעת התאוששות המונית וורטקס תקן שרירותי בגודל AuNP (50מ”ג∙L-1)במשך 2 דקות ולדלל אותו 1:4 עם UPW כדי להשיג ריכוז מסה סופי של 12.5 מ”ג∙L-1 . וורטקס במשך 2 דקות נוספות לאחר דילול כדי הומוגניזציה ההשעיה המתקבלת.התראה: אמצעי זהירות הכרחיים וציוד מגן מתאים נדרשים בעת עבודה עם כימיקלים, במיוחד כדורי NaOH.הערה: מומלץ בדרך כלל לבטל גז ולסנן את כל הפתרונות הדרושים (למעט פתרון הניקוי) באמצעות מסנן קרום 0.1 מיקרומטר (PVDF הידרופילי או דומה) כדי להבטיח רקע חלקיקי נמוך במהלך ניסויים AF4-UV-vis. ניתן להקים זאת על ידי יחידת סינון ואקום ייעודית או באמצעות מסנני מזרק. 3. הסמכת מערכת AF4-UV-vis השתמש בהגדרות התוכנה המתוארות בשלב 1.4 כדי לשטוף את המערכת עם פתרון הניקוי למשך 30 דקות (קצב זרימת טיפים 1 מ”ל∙מינימום-1,קצב זרימת מיקוד 1 מ”ל∙min-1 , וקצב זרימה צולבת 1.5 מ”ל∙מינימום-1). לשנות את הבקבוק eluent בהתאמה לשטוף את המערכת עם UPW במשך 20 דקות (קצב זרימת טיפ 1mL∙min-1, קצב זרימת מיקוד 1 mL∙min-1 , וקצב זרימה לחצות 1.5 מ”ל ∙min-1 ). החלף את מסנני המשאבה בתוך השורה המתאימים. פתח את מחסנית AF4 והחלף את קרום AF4. הרכיבו מחדש את מחסנית AF4 וחברו אותה מחדש למערכת AF4-UV-vis. לשטוף את מערכת AF4-UV-vis ניקה עם האלונט לפחות 30 דקות על מנת לייצב את הממברנה ולייצב את המערכת (קצב זרימת קצה 1 mL∙ מינימום-1,קצב זרימת מיקוד 1 מ”ל ∙ מינימום-1, וקצב זרימה צולבת 1.5 mL ∙min-1 ). בדוק שוב אם יש דליפות פוטנציאליות (ראה שלב 1.4). אשר את מערכת AF4-UV-vis על ידי קביעת השחזור ההמוני ושינוי זמן השמירה באמצעות תקן גודל שרירותי של AuNP. בצע הזרקה ישירה ללא יישום של כוח הפרדה. יצירת קובץ מדידה חדש על-ידי פתיחת קובץ | | חדשה הפעל בתוכנת הבקרה של AF4. הגדר את תיאור הדוגמה והמדידה, כמו גם את אמצעי האחסון להזרקה ואת השם לדוגמה בכרטיסיה הפעלה. תנאי המדידה מוצגים בטבלה 2. הגדר את פרמטרי המדידה בפעולת השירות FFF של הכרטיסיה השניה בהתאם לטבלה 2. לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל את המדידה. ביצוע הפעלת שבר עם יישום של כוח הפרדה (זרימה צולבת). הגדר את שיטת השבר כמתואר בסעיף הקודם באמצעות תנאי השבר שצוינו בטבלה 3. לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל את המדידה. בצע את המדידה בהכפלה מרובעת.הערה: ההפעלה הראשונה נועדה להתנות את המערכת (כלומר, קרום AF4) ולא תיכלל בהערכה הסופית של תוצאות ההסמכה של המערכת.הערה: מומלץ לשמור את כל קבצי ההפעלה שנוצרו על-ידי פתיחת קובץ | שמור בתוכנת הבקרה של AF4. שקול את AF4-UV-vis-מערכת מוסמך אם התאוששות המונית של >80% וריאציה של זמן שמירה <2% מתקבל עבור תקן גודל AuNP שרירותי. בעת שימוש autosampler כמו מערכת ההזרקה, למלא את בקבוק מאגר שטיפת המחט של autosampler עם אותו פתרון כי הוא נשאב דרך מערכת AF4-UV-vis (למשל, פתרון ניקוי, UPW, או eluent בהתאמה) כדי להבטיח תנאי הפעלה אופטימליים. בעת שינוי האלגנט, מומלץ בדרך כלל לעקוב אחר שיווי המשקל מחדש של מערכת AF4 על ידי ניטור אות גלאי UV-vis עד קו הבסיס שלו נשאר יציב ברמה קבועה. 4. ניתוח מדגם AF4-UV-vis הכינו את כל תקני הגודל של AuNP לכיול גודל חיצוני על ידי מערבולת המתלים המתאימים של AuNP (20 ננומטר, 40 ננומטר, 80 ננומטר, 100 ננומטר, כל אחד 50 מ”ג. L-1) במשך 2 דקות ולדלל אותו 1:4 עם UPW כדי להשיג ריכוז מסה סופי של 12.5 מ”ג ∙L-1. וורטקס במשך 2 דקות נוספות לאחר דילול כדי הומוגניזציה ההשעיות שהושגו. הכן את מדגם AuNP הלא ידוע לניתוח החלת אותו הליך כמו עבור תקני הכיול המתוארים בשלב 4.1. בצע מדידת הזרקה ישירה של כל תקני הגודל של AuNP בשיטת AF4 המוצגת בטבלה 2. כדי לעשות זאת, הזן את הערכים המתאימים המסוכמים בטבלה 2 לתוכנת היצרן במיקומים המתאימים כדי להגדיר את הפרמטרים של ההפרדה והדוגמית ולחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל בניסוי. חלק כל תקן גודל AuNP בנפרד באמצעות פעולת השירות AF4 המוצגת בטבלה 3 כדי ליצור את פונקציית כיול הגודל החיצוני. הזן את הערכים המתאימים המסוכמים בטבלה 3 לתוכנת היצרן במיקומים המתאימים. שיטת השבר מוגדרת על-ידי שלב התמקדות, מספר שלבי התרוממות רוח וצעד שטיפה. לאחר הגדרת השיטה, לחץ על לחצן הפעל כדי להפעיל את הניסוי. בצע מדידת הזרקה ישירה של מדגם AuNP לא ידוע באמצעות שיטת AF4 המוצגת בטבלה 2. בצע את השבר של מדגם AuNP הלא ידוע על-ידי ביצוע פעולת השירות AF4 המפורטת בטבלה 3. בצע את כל המדידות המוזכרות בסעיף 3 ו-4 בטריפל, אלא אם צוין אחרת כדי להבטיח תוצאות משמעותיות ורלוונטיות סטטיסטית. יש לאחסן 50מ”ג∙L-1 מתלים של מניית AuNP ב-4-8 מעלות צלזיוס לפני השימוש. מתלים מדוללים AuNP מוכנים באופן אידיאלי בתוך 30 דקות לפני היישום.הערה: Vortexing הוא בדרך כלל מספיק ואין ultrasonication של ההשעיות יש צורך. על מנת לאפשר מתאם של זמן השמירה של מדגם AuNP לא ידוע עם זמני השמירה שהושגו עבור תקני גודל AuNP, למדוד את כל הדגימות באמצעות אותה שיטה AF4.הערה: כדי להבטיח תנאי הפרדה קבועים וקשים, כלול/חזור על שלב השבר המתואר בסעיף ההסמכה של המערכת (ראה שלב 3.6.2) לאחר מספר מוגדר של מדידות מדגם (לדוגמה, 10 מדידות). בנוסף, רשום לחץ מערכת ויציבות בסיסית של גלאי UV-vis. הם צריכים להישאר יציבים וקבועים לאורך ריצה מלאה AF4-UV-vis.הערה: בדרך כלל, החלף את קרום אולטרה-סינון כאשר גלאי UV-vis (או גלאי פיזור אור רב-זוויתי (MALS), אם זמין) מציג רמת רעש מוגברת או קריטריוני ההסמכה המוגדרים של המערכת כגון התאוששות, צורת שיא לדוגמה או יכולת חזרה (או שמערכת AF4-UV-vis הייתה נתונה להליך ניקוי יסודי). בתנאים המתוארים כאן, מערכת AF4-UV-vis מוסמכת היא בדרך כלל יציבה לפחות 50 מדידות באמצעות קרום זהה; עם זאת, מספר המדידות הרצופות האפשריות העומדות בקריטריוני האיכות המוגדרים עשוי להשתנות באופן משמעותי בהתאם לדגימה, למטריצה לדוגמה ולהרכב האלונט. 5. הערכת נתונים בצע את חישוב השחזור ההמוני באמצעות תוכנת הערכת נתונים המסופקת על ידי יצרן המערכת AF4-UV-vis או ניתוח גיליון אלקטרוני לאחר ייצוא כל הנתונים הגולמיים הדרושים (כלומר, אזור השיא של UV-vis) מתוכנת רכישת הנתונים המתאימה בהתאם להוראות שניתנו במדריך היצרן. חשב את התאוששות מסת AuNP על-ידי השוואת האזורים תחת פסגות UV-vis המתאימות של מדידת השבר(שבר)ומדידת ההזרקה הישירה(הזרקה ישירה)באמצעות המשוואה הבאה:הערה: במהלך מדידת הזרקה ישירה, לא מוחל כוח הפרדה, ולכן ניתן להזניח אינטראקציות פוטנציאליות של מין מנתח עם דופן ההצטברות. האזור תחת פסגת UV-vis בהתאמה יכול להיות בקורלציה ישירה למסת AuNP באמצעות חוק באר למברט בהנחה ששום מין אחר בתוך המדגם לא סופג באורך הגל המתאים ו /או i) elutes בזמן שמירה אחר בתנאי שבר ii) מוסר דרך קרום AF4. יבא את קבצי dat. שהתקבלו הן מההזרקה הישירה והן מהפעלת השבר. בחר את המעקב אחר גלאי UV-vis בכרטיסיה מבט כולל. הגדר אזור עניין (ROI) וקו בסיס בתצוגת האות והתוכנית הבסיסית עבור כל המדידות. הכנס כיול הזרקה ישירה באמצעות הכנס. בחר את כל ריצות ההזרקה הישירה בתצוגת הגדרות כיול הזרקה ישירה והזן מקדם הכחדת UV.הערה: חשוב להשתמש באותו מקדם UV-vis הכחדה הן עבור הכיול והן עבור מדידת השבר. להקים את קו הכיול באמצעות האזור תחת עקבות אות UV-vis בתוך ההחזר על ההשקעה ואת הסכום מוזרק מחושב מן הריכוז שהוזן ואת נפח ההזרקה. הכיול המתקבל יוצג בחלון נפרד של פונקציית כיול הזרקה ישירה. הקצה את פונקציית הכיול למדידות השבר המתאימות.הערה: עבור כל תקן גודל כיול ודגימת AuNP לא ידועה, יש לקבוע פונקציית כיול נפרדת עקב ספיגת UV-vis תלוית הגודל של AuNP. חיסרון זה של גלאי UV-vis ניתן לעקוף באמצעות גלאי רגיש למסה כגון ICP-MS. בצע את הניתוחים על-ידי הוספת חישוב תוצאות כמותיות והתוצאות יוצגו בטבלה מימין כערכי ריכוז וכמות מוזרקת. חשב את וריאציית זמן השמירה באמצעות תוכנת הערכת נתונים שסופקה על-ידי יצרן המערכת AF4 או ניתוח גיליון אלקטרוני לאחר ייצוא כל הנתונים הגולמיים הדרושים (כלומר, זמני שמירה של תקני הכיול של AuNP בשיא ה- UV-vis בהתאמה ובזמני החלל המתאימים) מתוכנת רכישת הנתונים המתאימה בהתאם להוראות שניתנו במדריך היצרן. פתח את החלון מבט כולל כדי להציג את מעקבי UV המתאימים עבור כל המדידות המיובאות. זיהוי השיא יבוצע באופן אוטומטי; התאם את פרמטרי זיהוי השיא בארגז הכלים לעיבוד אותות כדי למטב את הביצועים. לחלץ את מקסימום שיא בהתאמה על ידי עובר את כל קבצי המדידה. חשב את סטיית התקן היחסית עבור כל המדידות באמצעות המשוואה הבאה:החישוב יכול להתבצע גם באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני בהתאמה. בצע קביעת גודל באמצעות תוכנת הערכת נתונים שסופקה על-ידי היצרן או ניתוח גיליון אלקטרוני לאחר ייצוא כל הנתונים הגולמיים הדרושים (זמן שמירה ב- UV-vis מקסימום שיא של ניתוח וזמן חלל בהתאמה) מתוכנת רכישת הנתונים המתאימה בהתאם להוראות שניתנו במדריך היצרן. ניתן לקבוע פונקציית כיול גודל חיצונית על-ידי התוויית זמני השמירה המתוקנים של זמן הריק (זמני שמירה נטו, ראה טבלה 5)של תקני הגודל של AuNP (20 ננומטר, 40 ננומטר, 80 ננומטר, 100 ננומטר) כנגד הגדלים ההידרודינמיים שלהם שהתקבלו ממדידות DLS שבוצעו בעבר (ראה טבלה 4).הערה: המדידות של DLS צריכות להתבצע באופן אידיאלי באותו יום שבו מתבצעות מדידות השבר המתאימות כדי להבטיח מאפייני דגימה דומים. לאחר ייבוא .dat כל הקבצים מוצגים בכרטיסייה מבט כולל. בחר את אות גלאי ה- UV-vis מרשימת הגלאים, המוצג מתחת לחלון הכיסוי. הגדר החזר על ההשקעה וקו הבסיס עבור כל מדידה, שניתן לכוונן בתצוגת אות וקו בסיס. השתמש בארגז הכלים לעיבוד אותות מימין כדי להחליק אותות רועשים. השתמש בפונקציה הקצאת פרמטרי עיבוד לפונקציות אחרות של Run כדי לאפשר הקצאה של הפרמטרים למידות אחרות, בהתאמה אותות. בחר בכיול גודל החלקיקים מהכרטיסיה הוספה. בחר את כל ריצות הכיול על-ידי לחיצה על המדידה המתאימה בטבלה בחר הפניות לכיול בצד השמאלי העליון. כל המידות שנבחרו יוצגו בטבלה שלהלן. הזן את הרדיוס ההידרודינמי עבור כל מדידות הכיול שצוינו בטבלה 4. הפונקציה תוצג בכיול גודל החלקיקים – חלון הפונקציה והמשוואה תוצג גם כן.הערה: מקדם המתאם (R2)של פונקציית כיול הגודל שנוצר חייב להיות ≥0.990. הקצה את פונקציית הכיול למידות של דוגמת AuNP הלא ידועה על-ידי בחירת השברים המתאימים ברשימה בחר פועל עבור הקצאה. הצג את התוצאות על-ידי פתיחת חישוב התפלגות גודל חלקיקים בתוך הכרטיסיה הוספה. כיול גודל החלקיקים שנוצר קודם לכן יופיע כלכיול עבור המדידות לדוגמה הלא ידועות של AuNP, המוצגות בהגדרותהחלון הימני . הגודל המחושב יוצג בחלון התפלגות הגודל המסומן כמקסימום שיא. בחר בתיבת הסימון אותות ממוצעים עבור דוגמה כדי לממוצע כל המדידות של מדגם אחד ופרט את התוצאה בתווית המרבית הגבוהה ביותר. בנוסף, התווה את קו הכיול מעל הפרקטוגרמה על-ידי בחירה בתיבת הסימון הצג עקומת כיול. התפלגות גודל מצטברת זמינה על-ידי בחירה בתיבת הסימון הצג התפלגות מצטברת.הערה: בעת שימוש בתוכנה של היצרן להערכת נתונים, מומלץ להוסיף את כל התוצאות לדוח, שניתן להפיק על-ידי לחיצה על דוח בתוך הכרטיסיה הוספה. לחצן דוח מוסיף את כל התוצאות, הטבלאות והדיאגרמות למסמך. תחת הכרטיסיה דוח, ניתן לשנות את הגדרות הדוח על-ידי פתיחת כיוונון דוח במקטע מסמך.

Representative Results

ראשית, תקני גודל AuNP היו מופרדים על ידי AF4 וזוהו על ידי UV-vis מדידת הספיגה של AuNP באורך גל של 532 ננומטר (תהודה פלסמון פני השטח של AuNP). כיסוי של הפרקטוגרמות המתקבלות מוצג באיור 1. זמני השמירה של כל AuNP בשיא UV-vis בהתאמה שלה המרבי המתקבל ממדידות משולשות מפורטים בטבלה 5. סטיית התקן היחסית של כל זמני השמירה הייתה מתחת ל-1.1% עם סטיית מדידה פוחתת עם הגדלת הגודל. בסך הכל הושגה חזרה מצוינת. כוח הפרדה מתמיד הופעל, מה שגרם למערכת יחסים ליניארית של זמן elution וגודל הידרודינמי. קו הכיול של הגודל החיצוני הוקם על-ידי התוויית הרדיוס ההידרודינמי שצוין כנגד זמן הריק המתוקן של זמן ההקצנה (זמן שמירה נטו). ניתוח רגרסיה ליניארית הביא לפונקציית כיול ליניארית עם יירוט a = -3.373 ננומטר ± 1.716 ננומטר ושיפוע b = 1.209 ננומטר∙ מינימום-1 ± 0.055 nm∙min-1. ההתנהגות הליניארית של elution אושרה עם מקדם מתאם בריבוע R2 של 0.9958. פונקציית הכיול המתאימה מוצגת באופן חזותי באיור 2. החלק השני עסק בניתוח מדגם AuNP לא ידוע. שלושה אלציטוטים של המדגם הוכנו בהתאם לנוהל המתואר בסעיף הפרוטוקול (סעיף 4.2). כל אחד משלושת aliquots נחקר משולש באמצעות אותה שיטת שבר AF4 כי הוחל גם על תקני גודל AuNP. כל תשעת הפרקטוגרמות AF4-UV-vis שהתקבלו מדגם AuNP הלא ידוע מוצגות באיור 3 וההערכות שלהן מסוכמות בטבלה 6. סטיית התקן היחסית של זמני השמירה בהתאמה הייתה נמוכה משמעותית וננועה בין 0.1% ל-0.5%. באמצעות פונקציית כיול גודל החלקיקים המתקבלת מהשבר של תקני הגודל של AuNP ומתאימה אותו עם זמני השמירה המתקבלים של מדגם AuNP הלא ידוע בשיא המרבי של UV-vis, ניתן לחשב רדיוס הידרודינמי ממוצע כולל של 29.4 ננומטר ± 0.2 ננומטר. יתר על כן, התאוששות המונית סבירה של 83.1% ± 1.2% הושגה המציין שום agglomeration משמעותי או פירוק של מדגם AuNP או ספיחה ניכרת של חלקיקים על פני השטח של הממברנה. איור 4 מציג את התפלגות גודל החלקיקים המתקבלת עם כל תשעת עקבות האותות של UV-vis בממוצע המדגישות את החוסן המצוין של שיטת AF4 שהוחלה. איור 1: AF4-UV-vis fractograms המתקבלים מניתוח משולש של ארבעת תקני הכיול הבודדים בגודל AuNP עם עוצמות אותות מנורמלות וקצב זרימה צולבת קבוע (קו שחור). שיא החלל מודגש באפור בסביבות 5.9 דקות. איור 2: פונקציית כיול גודל חיצוני שהתקבלה, כולל קווי שגיאה הנגזרים מסטיות התקן המתאימות של מדידות DLS ( טבלה 4 ) ושונות בזמני השמירה המתקבלים של AF4 (טבלה 5), לאחר התוויית הרדיוס ההידרודינמי שצוין כנגד זמן השמירה של כלתקןכיול גודל AuNP בודד בשיאו המרבי. פונקציית כיול ליניארית עם שגיאות סטנדרטיות בצורת y = a + bx עם = -3.373 ננומטר ± 1.716 ננומטר ו- b = 1.209 nm·min-1 ± 0.055 nm·min-1 חושב מניתוח רגרסיה ליניארית. נקבע מקדם מתאם בריבוע עם R2 = 0.9958, המציין קשר גומלין ליניארי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: AF4-UV-vis fractograms של מדידות משולשות של שלושה aliquots המציג את AuNP לא ידוע. קצב הזרימה הצולבת הקבוע המוחל לאורך זמן המדידה מאויר כקו שחור. שיא החלל בסביבות 5.9 דקות מודגש באפור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: כיסוי של התפלגות גודל החלקיקים הממוצע המתקבל (אדום) של מדגם AuNP לא ידוע ופונקציית הכיול הליניארית המוחלת (קו מנוקד). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. רכיב CAS-לא משקל (%) מים 7732-18-5 88.8 9-Octadecenoic חומצה (Z)-, תרכובת עם 2,2 ‘,2’-nitrilotris[אתנול](1:1) 2717-15-9 3.8 נתרן קרבונט 497-19-8 2.7 אלכוהול, C12-14 משני, אתוקסילי 84133-50-6 1.8 טטרסודיום אדטה 64-02-8 1.4 פוליאתילן גליקול 25322-68-3 0.9 נתרן אולאט 143-19-1 0.5 סודיום ביקרבונט 144-55-8 0.1 טבלה 1: רשימת המרכיבים של תערובת פעילי שטח המשמש להכנת eluent (ראה גם טבלה של חומרים). פרמטרי AF4-UV-vis יחידת ערך עובי מרווח מיקרומטר 350 קצב זרימה של גלאי mL מינימום-1 0.5 קצב זרימה צולבת mL מינימום-1 0 (קבוע במשך 8 דקות) קצב זרימת מיקוד mL מינימום-1 0 זמן השהיה / זמן ייצוב דקות 0 קצב הזרמת הזרקה mL מינימום-1 0.5 זמן מעבר דקות 0 זמן הזרקה דקות 0.1 שלב אלויון דקות 8 זמן שלב שטיפה דקות 0.1 שטף את קצב זרימת הצעדים mL מינימום-1 0.1 נפח הזרקה μL (μL) 10 ריכוז דגימה מ”גL-1 12.5 סוג ממברנה תאית מחדש ממברנה מולקולרית משקל מנותק kDa 10 אלונט (שני) תערובת פעילי שטח 0.025% (v/v) אורך גל UV-vis ננומטר 532 רגישות UV-vis – 0.001 טבלה 2: סיכום הפרמטרים של שיטת השבר AF4-UV-vis כדי לבצע את ריצת ההזרקה הישירה ללא יישום של כוח הפרדה. פרמטרי AF4-UV-vis יחידת ערך עובי מרווח מיקרומטר 350 קצב זרימה של גלאי mL מינימום-1 0.5 קצב זרימה צולבת mL מינימום-1 1 (קבוע 60 דקות, 10 דקות ליניארי) קצב זרימת מיקוד mL מינימום-1 1.3 זמן השהיה / זמן ייצוב דקות 2 קצב הזרמת הזרקה mL מינימום-1 0.2 זמן מעבר דקות 0.2 זמן הזרקה דקות 5 שלב אלויון דקות 70 (קבוע 60 דקות, 10 דקות ליניארי) שלב שטיפה דקות 9 שטף את קצב זרימת הצעדים mL מינימום-1 0.5 נפח הזרקה μL (μL) 50 ריכוז דגימה מ”גL-1 12.5 סוג ממברנה תאית מחדש ממברנה מולקולרית משקל מנותק kDa 10 אלונט (שני) תערובת פעילי שטח 0.025% (v/v) אורך גל UV-vis ננומטר 532 רגישות UV-vis – 0.001 טבלה 3: סיכום הפרמטרים של שיטת השבר AF4-UV-vis כדי לבצע את ריצת השבר עם יישום של זרימה צולבת ככוח הפרדה. תקן כיול סוכן מכסה גודל ממוצע (TEM) (nm) קורות חיים (גודל ממוצע TEM) (%) זטה פוטנציאל (mV) SD (פוטנציאל זטה) (mV) רדיוס הידרודינמי (DLS) (nm) SD (רדיוס הידרודינמי) (nm) PDI SD (PDI) AuNP 20 ננומטר ציטראט (ציטראט) 20.1 ≤ 8 -48.9 1.5 10.95 0.12 0.082 0.009 AuNP 40 ננומטר ציטראט (ציטראט) 40.8 ≤ 8 -30.4 1.0 20.30 0.13 0.127 0.006 AuNP 80 ננומטר ציטראט (ציטראט) 79.2 ≤ 8 -51.5 1.3 38.85 0.23 0.138 0.013 AuNP 100 ננומטר ציטראט (ציטראט) 102.2 ≤ 8 -50.9 0.9 52.30 0.37 0.078 0.009 טבלה 4: סיכום הפרמטרים הפיזיו-כימיים של תקני הכיול החלים של AuNP, כולל סוכן מכסה, גודל ממוצע של TEM, פוטנציאל זטה שנקבע בהשעיה המקורית, כמו גם רדיוס הידרודינמי של DLS, ומדד פולידיספרסיטי (PDI) שנקבע בהשעיה האמידה. תקן כיול להפעיל זמן שמירה בשיא מרבי (מינימום) זמן שמירה נטו בשיא מרבי (מינימום) זמן שמירה נטו ממוצע (מינימום) SD (%) (זמן שמירה נטו) SD (מינימום) (זמן שמירה נטו) AuNP 20 ננומטר 1 17.368 11.468 11.56 1.02 0.12 2 17.409 11.509 3 17.589 11.689 AuNP 40 ננומטר 1 25.316 19.416 19.49 0.68 0.13 2 25.32 19.42 3 25.548 19.648 AuNP 80 ננומטר 1 42.095 36.195 36.29 0.23 0.08 2 42.219 36.319 3 42.257 36.357 AuNP 100 ננומטר 1 50.975 45.075 45.06 0.07 0.03 2 50.924 45.024 3 50.986 45.086 טבלה 5: זמני השמירה של תקני הכיול של AuNP בשיא UV-Vis בהתאמה נגזרו מהפרקטוגרמות המתאימות של AF4-UV-vis בשיטה המתוארת בטבלה 3. אלציטוטה להפעיל זמן שמירה מרבי (מינימום) זמן שמירה ממוצע בשיא מרבי (מינימום) זמן שמירה נטו בשיא מרבי (מינימום) SD (%) זמן שמירה רדיוס הידרודינמי (nm) שחזור (%) 1 1 32.689 32.70 26.789 0.07 29.03 85.34 2 32.687 26.787 3 32.719 26.819 2 1 32.989 33.08 27.089 0.37 29.49 81.73 2 33.073 27.173 3 33.187 27.287 3 1 33.053 33.14 27.153 0.49 29.56 82.14 2 33.071 27.171 3 33.291 27.391 טבלה 6: סיכום זמני השמירה במקסימום השיא של UV-Vis בהתאמה, הרדיוס ההידרודינמי שחושב מכייל הגודל החיצוני (איור 2) וקצב ההחלמה של דגימת AuNP הלא ידועה המתקבלת מניתוח AF4-UV-vis.

Discussion

הגודל ההידרודינמי של AuNP לא ידוע הוערך במדויק על ידי AF4 יחד עם גלאי UV-vis באמצעות תקני גודל מוגדרים היטב של AuNP הנעים בין 20 ננומטר ל -100 ננומטר. שיטת AF4 המפותחת עברה אופטימיזציה באמצעות פרופיל זרימה צולבת קבוע על מנת ליצור קשר ליניארי בין זמן שמירה מדוד לגודל AuNP, ובכך לאפשר קביעת גודל פשוטה מניתוח רגרסיה ליניארית. התמקדות מיוחדת הייתה גם בהשגת שיעורי התאוששות גבוהים מספיק המציין שום אובדן מדגם משמעותי במהלך השבר, וכי שיטת AF4 שפותחה, כולל האלונט המוחל והממברנה התאימה היטב עם כל דגימות AuNP מופרדות.

פיתוח שיטה הוא ללא ספק הצעד הקריטי ביותר ב- AF4 וכמה פרמטרים, כולל ממדי ערוץ, פרמטרי זרימה, כמו גם eluent, קרום, גובה מרווח, ואפילו תכונות מדגם יש לקחת בחשבון על מנת לשפר את השבר בתוך חלון זמן elution נתון. מטרת פסקה זו היא להנחות את הקורא לאורך השלבים הקריטיים שמוטבו כדי לקבוע בהצלחה את גודל מדגם AuNP הלא ידוע הנדון כאן. לתיאור מפורט יותר של איך בדרך כלל לפתח שיטת AF4, הקורא מתייחס לסעיף AF4 של ‘ISO /TS21362:2018 – Nanotechnologies – ניתוח של ננו-אובייקטים באמצעות זרימה אסימטרית ושבר זרימת שדה צנטריפוגלי’25. לאחר מבט מקרוב על תנאי השבר החלים שניתנו בטבלה 3, הצעד הקריטי הראשון הוא הקדמה והרפיה של מדגם AuNP בערוץ AF4. שלב זה נשלט על ידי זרימת ההזרקה, זרימת המיקוד והזרימה הצולבת, אשר יחסי הגומלין שלהם מאלצים את המדגם לאתר קרוב לפני השטח של הממברנה ולרכז אותו ברצועה צרה ליד יציאת ההזרקה של ערוץ AF4 בעצם הגדרת נקודת ההתחלה של השבר. הרפיה מספקת של המדגם היא חובה כמו במהלך שלב זה, מדגם מרכיבים בגדלים שונים לאתר בגבהים שונים של ערוץ AF4 ובכך לספק את הבסיס לשבר גודל מוצלח. הרפיה מדגם לא שלם הוא בדרך כלל גלוי על ידי שטח שיא חלל מוגבר הנובע מרכיבים מדגם unretained (כלומר, לא רגוע). ניתן לצמצם אפקט זה על-ידי הגדלת זמן ההזרקה ו/או קצב הזרימה הצולבת המוחל. עם זאת, שני הפרמטרים זקוקים לאופטימיזציה זהירה, במיוחד עבור דגימות הנוטות להתלכדות וספיחות על קרום AF4, וניתן לפקח עליהם על ידי שיעורי השחזור המתאימים המתקבלים עבור הגדרות פרמטר שונות36,37. זמן ההזרקה החל של 5 דקות יחד עם קצב זרימה צולבת של 1.0mL∙min-1 גילה שיעורי התאוששות >80% עבור כל דגימות AuNP ואזור שיא חלל זניח המציין תנאי הרפיה כמעט אופטימליים. לאחר הרפיה מספקת של מדגם AuNP, זרימת המיקוד הופסקה והובלת מדגם לאורך ערוץ AF4 לגלאי UV-vis בהתאמה החלה המייצגת את הצעד הקריטי השני. על מנת להבטיח כוח שבר גבוה מספיק בזמני ניתוח סבירים, קצב זרימה צולבת קבוע של 1.0 mL∙min-1 למשך 30-50 דקות (בהתאם לתקן גודל AuNP המוקטן בהתאמה) ואחריו ריקבון זרימה צולבת ליניארית של 10 דקות בקצב זרימת גלאי של 0.5 מ”ל.min-1 הוחל. באמצעות פרופיל זרימה צולבת קבוע על פני ההפרדה של כל תקני גודל AuNP גילה קשר ליניארי בין זמן שמירה לגודל AuNP בעקבות FFF-Theory22, ובכך לאפשר קביעת גודל של מדגם AuNP לא ידוע על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית פשוטה. עם זאת, פרופילים שאינם זרימה צולבת מתמדת נוצלו גם לשינוי גודל של חלקיקים, ובסופו של דבר מובילים ליחסים לא ליניאריים בין זמן השמירה לגודל החלקיקים38,39. בנוסף, קביעת גודל AF4 באמצעות תקני גודל מוגדרים היטב אינה מוגבלת AuNP, אבל יכול להיות מיושם גם על חלקיקים עם גדלים אחרים הרכב אלמנטלי (למשל, כסף38,40 או חלקיקי סיליקה41,42). בנוסף, כאשר עובדים עם דגימות מדוללות, ICP-MS הוא גלאי יסוד רגיש מאוד, אשר ניתן לצמיד עם AF4, הוספת צדדיות של גישה אנליטית זו לשינוי גודל של מגוון גדול של חלקיקים בהשעיה.

למרות היישום הנרחב שלה, כיול גודל חיצוני באמצעות תקני גודל מוגדרים היטב AF4 יש כמה מוזרויות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש בו עבור גודל מדויק של דגימות לא ידועות. קודם כל, זה מסתמך במידה רבה על היישום של תנאים דומים במהלך השבר של תקני הגודל בהתאמה ואת המדגם בפועל. במקרה המוצג כאן, לכן חובה כי הן את תקני גודל AuNP, כמו גם את מדגם AuNP לא ידוע מופרדים באמצעות אותה שיטת AF4, כמו גם את אותה התרוממות רוח ואותו קרום מה שהפך גישה זו לבלתי גמישה למדי. יתר על כן, ללא גלאים רגישים לגודל, למשל, פיזור אור (MALS ו- DLS) בהישג יד, קשה לקבוע אם שיטת AF4 בהתאמה באמצעות תקני גודל עובד מספיק טוב או לא. זה נכון במיוחד עבור דגימות לא ידועות המציגות התפלגויות גודל רחבות מאוד, שם עדיין לא ברור אם כל המרכיבים מדגם בצע את דפוס elution נורמלי: שבר מחלקיקים קטנים יותר לגדולים יותר, או אם מרכיבי מדגם גדולים כבר elute במצב סטריק-hyperlayer ובכך פוטנציאל co-eluting עם מרכיבים מדגם קטןיותר 43,44. בנוסף, למרות FFF-התיאוריה מדגישה כי AF4 מפריד אך ורק על בסיס הבדלים בגודל הידרודינמי עם חלקיקים נחשבים מסות נקודה ללא כל אינטראקציות עם הסביבה שלהם22, המציאות מספרת סיפור אחר עם חלקיק חלקיקים וחלקיקים-לי אינטראקציות ממברנה (כגון משיכה אלקטרוסטטית / דחייה או ואן דר-ואלס אטרקציה) עשוי לשחק תפקיד ניכר והוא יכול להציג הטיה מדידה לתוך קביעות גודל באמצעות כיול גודל חיצוני45,46. לכן מומלץ להשתמש בתקני גודל התואמים באופן אידיאלי את הרכב ואת תכונות פני השטח (פוטנציאל זטה) של החלקיק שלעניין 40,42 או, אם אלה אינם זמינים, לפחות להשתמש בתקני גודל חלקיקים מאופיינים היטב (למשל, חלקיקי לטקס פוליסטירן) ולהעריך בזהירות את ההשלמות שלהם עם החלקיק של עניין במיוחד במונחים של פוטנציאל זטה פני השטח שלהם בסביבה המתאימה, שבו הניתוח יבוצע41,47.

הרבגוניות של AF4 נחשבת לעתים קרובות לעוצמתה הגדולה ביותר, שכן היא מציעה טווח יישומים החורג מרוב טכניקות הגודל הנפוצות האחרות בתחום זה22,48,49. עם זאת, בשל המורכבות הנלווית אליו, הוא עשוי להיחשב גם כחיסרון המשמעותי ביותר שלו במיוחד נגד טכניקות שינוי גודל מהירות וקלות לשימוש לכאורה כגון DLS, ניתוח מעקב חלקיקים או חלקיק יחיד ICP-MS. עם זאת, כאשר מכניסים את AF4 לפרספקטיבה עם טכניקות שינוי גודל פופולריות אלה, מתברר כי לכל הטכניקות יש את היתרונות והחסרונות שלהן, אך כולן תורמות להבנה מקיפה יותר של האופי הפיזיו-כימי של חלקיקים ולכן יש לראות בהן משלימות ולא תחרותיות.

נוהל הפעולה הסטנדרטי (SOP) המוצג כאן, מדגיש את הישימות המצוינת של AF4-UV-vis עם כיול גודל חיצוני לשינוי גודל של מדגם AuNP לא ידוע בהשעיה ובסופו של דבר הוחל כקו מנחה מומלץ לניתוח AF4 של מדגם AuNP לא ידוע בתוך השוואה בינלאומית interlaboratory (ILC) שנערך במסגרת פרויקט Horizon 2020, ACEnano (התוצאה של ILC זה יהיה הנושא של פרוטוקול זה, אם כן, מסתכם במאמצים הבינלאומיים המעודדים והמתמשכים לאמת ולתקנן מתודולוגיות AF425,50,51,52 המדגישות את הפוטנציאל המבטיח של AF4 בתחום אפיון הננו-חלקיקים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לכל קונסורציום ACEnano על דיונים פוריים לאורך כל שלבי הכנת הפרוטוקול המוצג כאן. המחברים מעריכים גם מימון מתוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי (H2020) במסגרת הסכם המענק nº 720952 במסגרת פרויקט ACEnano.

Materials

0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF) Postnova Analytics GmbH Z-FIL-TEF-002 Used for filtration of aqueous solutions
0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm) Merck Millipore Durapore Millex Used for filtration of NovaChem100
Adjustable Volume Pipettes (1000 µL) Eppendorf AG Research Plus Used to prepare diluted AuNP suspensions
AF4 cartridge Postnova Analytics GmbH AF2000 MF – AF4 Analytical Channel Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
AF4 Membrane – Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO) Postnova Analytics GmbH Z-AF4-MEM-612-10KD Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Analytical Balance (0.1 mg precision) Sartorius ENTRIS124I-1S Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution
Autosampler Postnova Analytics GmbH PN5300 Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Channel Oven Postnova Analytics GmbH PN4020 Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Crossflow Module Postnova Analytics GmbH AF2000 MF Control Module Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Disposable Pipette Tips (1000 µL) Eppendorf AG ep T.I.P.S Used to prepare diluted AuNP suspensions
Flasks (e.g. 2 liter volume) neoLab 1-0199 Used for eluent storage
Focus Pump Postnova Analytics GmbH PN1131 Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) Postnova Analytics GmbH VIA-002 Used for sample storage
Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) Postnova Analytics GmbH NovaCal Gold 50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function
Magnetic Stirrer IKA VIBRAX-VXR Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW
Personal Computer (PC) Dell Technologies / Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual
Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.) / / In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials
Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume) Postnova Analytics GmbH Z-VIA-09150868 Used for sample storage
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade Carl Roth GmbH & Co KG 2326.1 Used for the preparation of the cleaning solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a Carl Roth GmbH & Co KG 6771.1 Used for the preparation of the cleaning solution
Software Package for Control and Data Acquisition Postnova Analytics GmbH NovaFFF AF2000 Software Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual
Software Package for Data Evaluation Postnova Analytics GmbH NovaAnalysis Software Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual
Software Package for final Data Processing OriginLab Corporation Origin 2019 Used for final data processing
Solvent Degasser Postnova Analytics GmbH PN7520 Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Solvent Selector Postnova Analytics GmbH PN7310 Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Solvent Organizer Postnova Analytics GmbH PN7140 Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Surfactant Mixture Postnova Analytics GmbH NovaChem100 Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation
Tip Pump Postnova Analytics GmbH PN1130 Component of the AF2000 MF – MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Unknown AuNP sample BBI Solutions EM.GC60 60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function
UV-vis Detector Postnova Analytics GmbH PN3211 UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system
Vacuum Filtration Unit Postnova Analytics GmbH Eluent Filtration System Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions
Vortex IKA Vortex Genie 2 Used for homogenization of diluted AuNP suspensions
Water Purification System Merck Millipore Milli-Q Integral 5 Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Gold nanoparticles in biology and medicine: recent advances and prospects. Acta Naturae. 3 (2), 34-55 (2011).
  2. Wagner, F. E., et al. Before striking gold in gold-ruby glass. Nature. 407 (6805), 691-692 (2000).
  3. Hunt, L. B. The true story of Purple of Cassius. Gold Bulletin. 9 (4), 134-139 (1976).
  4. Higby, G. J. Gold in medicine. Gold Bulletin. 15 (4), 130-140 (1982).
  5. Faraday, M. X. The Bakerian Lecture. -Experimental relations of gold (and other metals) to light. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 147, 145-181 (1857).
  6. Borries, B. v., Kausche, G. A. Übermikroskopische Bestimmung der Form und Größenverteilung von Goldkolloiden. Kolloid-Zeitschrift. 90 (2), 132-141 (1940).
  7. Turkevich, J., Hillier, J. Electron Microscopy of Colloidal Systems. Analytical Chemistry. 21 (4), 475-485 (1949).
  8. Homberger, M., Simon, U. On the application potential of gold nanoparticles in nanoelectronics and biomedicine. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 368 (1915), 1405-1453 (2010).
  9. Cordeiro, M., Ferreira Carlos, F., Pedrosa, P., Lopez, A., Baptista, P. V. Gold Nanoparticles for Diagnostics: Advances towards Points of Care. Diagnostics. 6 (4), 43 (2016).
  10. Vines, J. B., Yoon, J. H., Ryu, N. E., Lim, D. J., Park, H. Gold Nanoparticles for Photothermal Cancer Therapy. Frontiers in Chemistry. 7, 167 (2019).
  11. Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Therapeutic Delivery. 3 (4), 457-478 (2012).
  12. Safh, B. P., Antosh, M. Effect of size on gold nanoparticles in radiation therapy: Uptake and survival effects. Journal of Nanomedicine. 2 (1), 1013-1020 (2019).
  13. Haiss, W., Thanh, N. T. K., Aveyard, J., Fernig, D. G. Determination of size and concentration of gold nanoparticles from UV-Vis spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4215-4221 (2007).
  14. Zheng, T., Bott, S., Huo, Q. Techniques for accurate sizing of gold nanoparticles using dynamic light scattering with particular application to chemical and biological sensing based on aggregate formation. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (33), 21585-21594 (2016).
  15. Liu, J., Murphy, K. E., MacCuspie, R. I., Winchester, M. R. Capabilities of single particle inductively coupled plasma mass spectrometry for the size measurement of nanoparticles: a case study on gold nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (7), 3405-3414 (2014).
  16. Contado, C., Argazzi, R. Size sorting of citrate reduced gold nanoparticles by sedimentation field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9088-9098 (2009).
  17. Calzolai, L., Gilliland, D., Garcìa, C. P., Rossi, F. Separation and characterization of gold nanoparticle mixtures by flow-field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1218 (27), 4234-4239 (2011).
  18. Schmidt, B., et al. Quantitative characterization of gold nanoparticles by field-flow fractionation coupled online with light scattering detection and inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (7), 2461-2468 (2011).
  19. Mekprayoon, S., Siripinyanond, A. Performance evaluation of flow field-flow fractionation and electrothermal atomic absorption spectrometry for size characterization of gold nanoparticles. Journal of Chromatography. A. , (2019).
  20. López-Sanz, S., Rodríguez Fariñas, N., Zougagh, M., Rios, A., Rodriguez Martín-Doimeadios, R. C. C. AF4-ICP-MS as a powerful tool for the separation of gold nanorods and nanospheres. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. , (2020).
  21. Giddings, C. J. A new separation concept based on a coupling of concentration and flow nonuniformities. Separation Science. 1 (1), 123-125 (1966).
  22. Schimpf, M. E., Caldwell, K., Giddings, J. C. . Field-flow fractionation handbook. , (2000).
  23. Contado, C. Field flow fractionation techniques to explore the “nano-world”. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (10), 2501-2518 (2017).
  24. Wahlund, K. G., Giddings, J. C. Properties of an asymmetrical flow field-flow fractionation channel having one permeable wall. Analytical Chemistry. 59 (9), 1332-1339 (1987).
  25. ISO. ISO /TS 21362:2018 Nanotechnologies – of nano-objects using asymmetrical-flow and centrifugal field-flow fractionation. ISO. , (2018).
  26. Gogos, A., Kaegi, R., Zenobi, R., Bucheli, T. D. Capabilities of asymmetric flow field-flow fractionation coupled to multi-angle light scattering to detect carbon nanotubes in soot and soil. Environmental Science: Nano. 6 (1), 584-594 (2014).
  27. Müller, D., et al. Integration of inverse supercritical fluid extraction and miniaturized asymmetrical flow field-flow fractionation for the rapid analysis of nanoparticles in sunscreens. Analytical Chemistry. 90 (5), 3189-3195 (2018).
  28. Capomaccio, R., et al. Gold nanoparticles increases UV and thermal stability of human serum albumin. Biointerphases. 11 (4), (2016).
  29. Levak, M., et al. Effect of protein corona on silver nanoparticle stabilization and ion release kinetics in artificial seawater. Environmental Science & Technology. 51 (3), 1259-1266 (2017).
  30. Mehn, D., et al. Larger or more? Nanoparticle characterisation methods for recognition of dimers. RSC Advances. 7 (44), 27747-27754 (2017).
  31. Sogne, V., Meier, F., Klein, T., Contado, C. Investigation of zinc oxide particles in cosmetic products by means of centrifugal and asymmetrical flow field-flow fractionation. Journal of Chromatography. A. 1515, 196-208 (2017).
  32. Cumberland, S. A., Lead, J. R. Particle size distributions of silver nanoparticles at environmentally relevant conditions. Journal of Chromatography. A. 1216 (52), 9099-9105 (2009).
  33. de Carsalade du pont, V., et al. Asymmetric field flow fractionation applied to the nanoparticles characterization: Study of the parameters governing the retention in the channel. International Congress of Metrology. , (2019).
  34. Loeschner, K., et al. Optimization and evaluation of asymmetric flow field-flow fractionation of silver nanoparticles. Journal of Chromatography. A. 1272, 116-125 (2013).
  35. Mudalige, T. K., Qu, H., Linder, S. W. An improved methodology of asymmetric flow field flow fractionation hyphenated with inductively coupled mass spectrometry for the determination of size distribution of gold nanoparticles in dietary supplements. Journal of Chromatography. A. 1420, 92-97 (2015).
  36. Dubascoux, S., Von Der Kammer, F., Le Hécho, I., Gautier, M. P., Lespes, G. Optimisation of asymmetrical flow field flow fractionation for environmental nanoparticles separation. Journal of Chromatography. A. 1206 (2), 160-165 (2008).
  37. Hagendorfer, H., et al. Application of an asymmetric flow field flow fractionation multi-detector approach for metallic engineered nanoparticle characterization – and limitations demonstrated on Au nanoparticles. Analytica Chimica Acta. 706 (2), 367-378 (2011).
  38. Geiss, O., Cascio, C., Gilliland, D., Franchini, F., Barrero-Moreno, J. Size and mass determination of silver nanoparticles in an aqueous matrix using asymmetric flow field flow fractionation coupled to inductively coupled plasma mass spectrometer and ultraviolet-visible detectors. Journal of Chromatography. A. 1321, 100-108 (2013).
  39. Makselon, J., Siebers, N., Meier, F., Vereecken, H., Klumpp, E. Role of rain intensity and soil colloids in the retention of surfactant-stabilized silver nanoparticles in soil. Environmental Pollution. 238, 1027-1034 (2018).
  40. Bolea, E., Jiménez-Lamana, J., Laborda, F., Castillo, J. R. Size characterization and quantification of silver nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (9), 2723-2732 (2011).
  41. Barahona, F., et al. Simultaneous determination of size and quantification of silica nanoparticles by asymmetric flow field-flow fractionation coupled to ICPMS using silica nanoparticles standards. Analytical Chemistry. 87 (5), 3039-3047 (2015).
  42. Aureli, F., D’Amato, M., Raggi, A., Cubadda, F. Quantitative characterization of silica nanoparticles by asymmetric flow field flow fractionation coupled with online multiangle light scattering and ICP-MS/MS detection. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30, 1266-1273 (2015).
  43. Myers, M. N., Giddings, J. C. Properties of the transition from normal to steric field-flow fractionation. Analytical Chemistry. 54 (13), 2284-2289 (1982).
  44. Giddings, J. C. Retention (steric) inversion in field-flow fractionation: practical implications in particle size, density and shape analysis. Analyst. 118 (12), 1487-1494 (1993).
  45. Wahlund, K. G. Flow field-flow fractionation: Critical overview. Journal of Chromatography. A. 1287, 97-112 (2013).
  46. Bendixen, N. L., Adlhart, S., Lattuada, C., Ulrich, A. Membrane-particle interactions in an asymmetric flow field flow fractionation channel studied with titanium dioxide nanoparticles. Journal of Chromatography A. 1334, 92-100 (2014).
  47. Qu, H., Quevedo, I. R., Linder, S. W., Fong, A., Mudalige, T. K. Importance of material matching in the calibration of asymmetric flow field-flow fractionation: material specificity and nanoparticle surface coating effects on retention time. Journal of Nanoparticle Research. 18 (10), 292 (2016).
  48. Giddings, J. C. Field-flow fractionation: analysis of macromolecular, colloidal, and particulate materials. Science. 260 (5113), 1456-1465 (1993).
  49. Cascio, C., Gilliland, D., Rossi, F., Calzolai, L., Contado, C. Critical experimental evaluation of key methods to detect, size and quantify nanoparticulate silver. Analytical Chemistry. 86 (24), 12143-12151 (2014).
  50. Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution by asymmetric flow field flow fractionation: a powerful method for the pre-clinical characterisation of lipid-based nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 756-767 (2019).
  51. Parot, J., Caputo, F., Mehn, D., Hackley, V. A., Calzolai, L. Physical characterization of liposomal drug formulations using multi-detector asymmetrical-flow field flow fractionation. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 320, 495-510 (2020).
  52. ASTM. ASTM WK68060 – New Test Method for Analysis of Liposomal Drug Formulations using Multidetector Asymmetrical-Flow Field-Flow Fractionation (AF4). ASTM. , (2019).

Tags

Asymmetrical Flow Field-flow FractionationAF4Gold NanoparticlesSize DistributionSuspensionExternal Size CalibrationNanoparticle Size StandardsUV-vis DetectionSample PreparationSystem QualificationFractionation Method Parameters

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Drexel, R., Sogne, V., Dinkel, M., Meier, F., Klein, T. Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension. J. Vis. Exp. (163), e61757, doi:10.3791/61757 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image