Burada, donmuş örneklerin dinamik nükleer polarizasyon (DNP) sihirli açı eğirme (MAS) nükleer manyetik rezonans (NMR) probuna kriyojenik transferi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, deneyden önce rotor depolaması için yol tariflerini ve deneyden önce ve sonra uygulanabilirlik ölçümleri için yol tariflerini içerir.
Dinamik nükleer polarizasyon (DNP), sihirli açı eğirme (MAS) nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisinin hassasiyetini önemli ölçüde artırabilir. Sıcaklıklar azaldıkça bu hassasiyet artar ve çoğu ticari DNP donanımlı NMR spektrometresinin çalışma sıcaklıklarında (~100 K) çok düşük konsantrasyonlarda moleküllerin çalışmasını sağlayacak kadar büyüktür. Bu, kriptoopreze edilmiş hücreler üzerinde hücre içi yapısal biyolojinin, makromoleküller için kendi yerel ortamlarında endojen seviyelerinde olma olasılığına yol açar. Bununla birlikte, DNP MAS NMR için tipik numune kullanımı sırasında hücresel kriyoprezervasyon için gereken donma oranları aşılır ve bu da hücresel bütünlük ve canlılık kaybına neden olur. Bu makalede, donmuş bir memeli hücresi örneğinin MAS NMR spektrometresine hazırlanması ve kriyojenik transferi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.
Sihirli açı dönen nükleer manyetik rezonans spektroskopisi için dinamik nükleer polarizasyonun tanıtılması MAS NMR’nin hassasiyetini çeşitli büyüklük sıralarıyla artırabilir. Bu, biyomoleküllerin fizyolojik konsantrasyonlarında veya yakınında tespitini sağlamıştır. DNP, karmaşık biyolojik ortamda endojen (~1 μM) konsantrasyonlarda izotopik olarak etiketlenmiş bir proteini tespit etmek için gereken hassasiyeti sağlayabilir ve sağlar1. İzotopik olarak etiketlenmiş molekülleri canlılıklarını etkilemeden etiketlenmemiş memeli hücrelerine tanıtmak için iyi kurulmuş protokoller olduğundan, bu, izotopik olarak zenginleştirilmiş biyomolekülleri kendi doğal ortamlarında endojen seviyelerinde inceleme imkanını açar. Ayrıca, DNP geliştirmeleri daha düşük sıcaklıklarda daha verimli olduğundan2,3,4, DNP MAS NMR için deneysel sıcaklıklar, canlı memeli hücrelerinin uzun süreli depolanması için gerekli olanlarla düzgün bir şekilde hizalanır5. Bununla birlikte, bir numuneyi DNP MAS NMR spektrometresine aktarmanın geleneksel yöntemi, onu memeli hücrelerini yırtan sıcaklık dalgalanma oranlarına maruz bırakmaz.
MAS NMR deneyleri, örneğin sıfıra ortalaması için anisotropik etkileşimin büyüklüğüne eşit veya daha büyük frekanslarda sihirli açı hakkında döndürülmesi gerekir, genellikle en az 4 kHz ve genellikle çok daha yüksek6,7,8,9. Bu nedenle, numuneler, rotorun dönüşünü bir gaz akışıyla yönlendirmek için kullanılan ve diğer ucunda bir işarete sahip olan kanatlı bir ucu olan rotorlara paketlenmiştir, böylece dönüş frekansı bir takometre ile izlenebilir. Çoğu MAS NMR cihazı için numune transferi, rotorun cihazın dış kısmından NMR probunun sonundaki statora kuru hava veya azot gazı akışı ile enjekte ederek gerçekleştirilir. Rotor, rotoru sihirli açıda tutan statora ulaştıktan sonra, numune dönüşü bir hava türbini mekanizması tarafından tahrik edilir. Ayrı gaz akışları rotorun sıcaklığını destekler, iter ve kontrol eder. NMR spektrometresine bir rotor takmak ve kararlı MAS eğirme elde etmek, ince işlenmiş tahrik uçları ve ayrı gaz akışlarının sıcaklığının ve basıncının sıkı kontrolünü gerektirir. Bu teknik taleplere rağmen, oda sıcaklığı uygulamaları için ticari MAS NMR probları için kararlı MAS ekleme ve elde etme büyük ölçüde otomatikleştirilmiştir.
Ancak, düşük sıcaklık uygulamaları için durum daha karmaşıktır. Düşük sıcaklık uygulamaları için numuneler tipik olarak oda sıcaklığında spektrometreye yerleştirilir ve statorda dondurulur. İlk dakikada, numune sıcaklığı hızla azalır (> −100 °C/dk) ve sistem sıcaklığının dengeye girmesi birkaç dakika sürer. Sıcaklık ve basıncın etkileşimi nedeniyle, istenen MAS’ın yerleştirilmesi ve yaklaşması genellikle düşük sıcaklık uygulamaları için manuel olarak ele alınır. Manuel müdahale gereksinimine rağmen, rotorun cihazın içinde dondurulması faydalıdır, çünkü başarılı eğirme için kritik olan prob içine su ve yoğuşma girişini en aza indirir. Sadece ortam nem bloğu gaz hatlarından yoğuşma ve buz birikmesi, rotorun kendisi üzerindeki yoğuşma veya don MAS’ı mekanik olarak önleyebilir. Bu nedenle, düşük sıcaklık MAS NMR örnekleri genellikle cihazın içinde -100 °C/dk’yi aşan oranlarda dondurulur.
Memeli hücreleri, soğutma 5 , 10 ,11,12,1°C / dak’tan eşit veya daha yavaş bir hızda yavaşsa, donma-çözülme döngüsü ile bütünlüklerini koruyabilirler. Alternatif olarak, soğutma hızı ultra hızlıysa hücreler de bütünlüğünü korur13,14,15 ,104 °C/dak’tan daha hızlı bir hızda. Bu iki uç noktaya orta oranlar, kriyoprotektif ajanların varlığında bile, hücrelerin içinde ve dışında buz kristali oluşumu nedeniyle memeli hücrelerini yırtıyor ve öldürüyor16. Önceden soğutulmuş bir probun içindeki bir oda sıcaklığı rotorunun numune soğutma oranları bu iki uç nokta arasına düşer, böylece kriyogenik olarak korunmuş bozulmamış canlı memeli hücrelerini incelemek için, numuneler cihaza aktarılmadan önce dondurulmalı ve rotordaki don örneğine veya birikmesine zarar verebilecek sıcaklık dalgalanmaları olmadan cihaza aktarılmalıdır. Protokol, kriyojenik bir MAS NMR sistemine donmayan, önceden soğutulmuş rotor yerleştirme için kriyogenik olarak korunmuş bozulmamış canlı memeli hücre örneklerinin incelenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan kriyojenik örnek transferi, canlı sağlam hücrelerin NMR karakterizasyonu için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, sıcaklık dalgalanmalarının numune bütünlüğünü tehlikeye atabileceği herhangi bir sistem için geçerlidir. Bu, sıkışmış reaksiyon ara maddelerinin kimyasal ve yapısal karakterizasyonu için dondurulan söndürülen reaksiyonlar17 , 18,enzymoloji19,20 veya protein katlama21,22gibi çeşitli karmaşık sistemleri içerir.
Donmuş numunelerin bir NMR spektrometresine kriyojenik transferi, NMR veri toplama yoluyla donmuş memeli hücrelerinin canlılığını korumada başarılıdır. Bu metodolojinin başarısı MAS NMR öncesi ve sonrası canlılık ölçümlerinde gösterilmiştir. Bu yaklaşım, sıcaklık dalgalanmalarının numune bütünlüğünü tehlikeye atabileceği herhangi bir sistem için başarılı ve genelleştirilebilir. Şu anda sunulan protokol HEK 293 hücre hattı ile gerçekleştirilir. Birçok memeli hücre hattı için kriyoprezervasyon koşulları çok benzer olduğundan, burada bildirilen koşulların diğer hücresel sistemlere çevrilebilir olması muhtemeldir; ancak, aynı sonuçları elde etmek için kriyoprotektanların, numune hacimlerinin ve donma oranlarının daha fazla optimizasyonu gerekebilir.
Bu metodoloji, rotorun NMR sonrası daha hızlı bir şekilde açılmasıyla geliştirilebilir. Bu adım şu anda alt optimal ve yürütülmesi hücrelerin uygulanabilirliğini etkiler. Hücrelerin ortama yeniden kullanılabilmesi için önce tahrik ucu ve silikon fişin rotordan çıkarılması gerekir. Tahrik ucunun çıkarılması sırasında rotor tutulduğunda numune düzensiz bir şekilde çözülür ve silikon fiş çok daha kısa rotor kullanım süreleri daha yüksek canlılıklara neden olur. Rotor tutucuların veya diğer aletlerin geliştirilmesi, tahrik ucunun ve silikon fişin düzgün çözülmesini ve hızlı bir şekilde çıkarılmasını kolaylaştırmak için NMR sonrası canlılık değerlendirmesini daha doğru hale getirmeye yardımcı olacaktır.
Bu makalede açıklanan kriyojenik numune yükleme yaklaşımı, NMR mıknatısının deliğinde bulunan prob ile numune ekleme ve çıkarmayı destekleyen NMR probları ile sınırlıdır. Harici numune ekleme ve çıkarma ticari DNP sistemleri için standart olsa da, özel problar her zaman bu seçeneğe sahip değildir. Ayrıca, kriyojenik numune yüklemeye yönelik bu yaklaşım, farklı boyutlu rotorlarla uyumlu olacak şekilde oluşturulmuş NMR probları için bazı değişiklikler gerektirebilir. Bu protokol 3,2 mm rotorlar için optimize edilmiştir ve numune tutucunun dış çapı bir mikrosantrifüj tüpünün iç çapını aşarsa (örneğin, adım 3.4.2) değişiklik gerektirebilir.
DNP’nin MAS NMR’ye uygulanmasıyla, endojen fizyolojik konsantrasyonlarda proteinleri ve diğer biyomolekülleri tespit etmek artık mümkündür24,25,26. Bu, biyomolekülleri kendi ortamlarında inceleme olasılığını açar. Deney boyunca hücresel bütünlüğün ve canlılığın korunması, spektroskopinin deneysel sonuçlarını biyolojik olaylara bağlamada kritik öneme sahip olacaktır. Saflaştırılmış proteinler veya hücresellyatlar içeren numunelerin kontrolsüz dondurulması tipik olarak numune kalitesinden ödün vermez7,27, ancak saflaştırılmış sistemlerde bile donma oranının önemli bir değişken olabileceğine dair bazı göstergeler vardır28. Bununla birlikte, hücresel sağlamlığı ve canlılığı korumak yorum için önemliyse, memeli hücrelerinin örneklerinin kontrollü bir hızda dondurulması gerekir. Burada, memeli hücrelerinin donmuş örneklerinin dondurulması ve önceden soğutulmuş bir DNP MAS NMR cihazına aktarılması için potansiyel olarak zarar verici sıcaklık dalgalanmalarını önleyen ve uygulanabilir hücreler üzerinde ölçümü destekleyen bir protokol sunuyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Teksas Kanser Araştırma Önleme ve Araştırma Enstitüsü [RR150076], Ulusal Bilim Vakfı [1751174]; Ulusal Sağlık Enstitüleri [NS-111236], Welch Vakfı [1-1923-20170325]; Lupe Murchison Vakfı, Ted Nash Uzun Yaşam Vakfı ve Akrabalık Vakfı (Searle Scholars Programı) K.K.F.
0.4% Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | |
100 mm cell culture dish | Thomas Scientific | 430167 | |
150 mm cell culture dish | Nunc | 157150 | |
3.2 mm sapphire rotor | Bruker | ||
45 ° angled forceps | Hampton Research | HR4-859 | |
AMUPol | Cortecnet | C010P005 | |
Black and Silver marker | Sharpie | ||
Cap removing tool | Bruker ? | ||
Cell culture grade water | HyClone | SH30529.03 | |
Ceramic cap | Bruker | ||
CoolCell | Corning/ Biocision | UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion) | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10288 | |
Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Cryogen tubes | Nalgene | 03-337-7Y | |
d8-glycerol | Aldrich | 447498 | |
Deuterium oxide, 99.8 % atom D | Aldrich | 756822-1 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
DNP NMR system with 1.7 T cryogen free gyrotron | Bruker | ||
Foam dewar | Spearlab | FD-800 | |
Kimwipes | Kimwipes | ||
Packaging tool | Bruker ? | ||
Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
Powdered PBS | VWR | VWRRV0780 | |
Protonated PBS | Gibco | 10010-023 | |
Silicon plug | Bruker | ||
Standard Vessel forceps | |||
Tryp-L | Gibco | 12605010 |