細胞生存率を維持するマジックアングル回転核磁気共鳴分光計への低温サンプルローディング

哺乳類細胞の培養と凍結保護 哺乳類細胞の培養と収穫 凍結されたヒト胚性腎臓細胞のアリコートを解凍する(HEK 293)。 培養HEK 293細胞は、成長培地中で(例えば、10%のウシ血清と1%のペンストレップを有するDMEM)37°Cで、100mmプレートで5%CO2を2〜3回(7〜10日間)で培養した。 細胞と培養物を150mmのプレートに分割し、90~95%の合流まで培養します。注:>90%の合流度で150 mmの版は3.2 mmの直径の2つのサファイアローターを満たすのに十分である。 4 mLのトリプシン(材料表を参照)と10 mLの培地を使用して細胞を収穫します。懸濁液を673 x g(1000 rpm)で無菌15 mL円錐形および遠心分離機に室温で5分間移動します。上清を取り除く。 リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞ペレットを洗浄します(pH 7.4、 -CaCl2、- MgCl2)。 細胞の凍結保護 マイクロ遠心チューブに50μLの細胞ペレットを取り付けます。PBS 50 μL とグリセロール 18 μL の混合物を別のチューブに用意します。 グリセロール-PBS混合物をペレットの上部に加え、塊が残らなくなるまでチューブの側面を軽くタップしてペレットを再懸濁させることで、グリセロール-PBS混合物の68 μLと50 μLの細胞ペレットを穏やかに混合します。注:穏やかなピペットは、細胞を再中断するために使用することができますが、細胞の完全性が損なわれないようにしてください。 2. NMRローターにおける哺乳類細胞の凍結保存 セルを3.2 mmサファイアローターに移す。 漏斗を作るために、200 μLピペットの先端を切り、切ったピペットの先端の狭い端を3.2 mmローターに挿入します。 ローターに座っている漏斗に細胞を移す。マイクロ遠心チューブにじょうごと一緒にローターを置き、セルをローターの底にペレットに入れ、673 x g で室温で2〜3分間遠心します。 上清と余分なサンプルをローターから取り除きます。ローターがセルを完全に詰め込むまで、この2つの手順を繰り返します。注: 必要に応じて、凍結する前にサンプルの細胞の生存率を決定します。FBSフリーDMEMの100 μLに過剰な細胞ペレットの10 μLを再懸濁します。懸濁液の10 μLを0.4%のトリパンブルー溶液と混合し、自動化されたセルカウンターを使用してすぐに生存率を評価します。細胞を希釈するには、FBSフリーの培地のみを使用して、細胞を希釈し、トリパンブルー染色を妨げます。 市販の梱包ツールを使用して、シリコンプラグでローターを密封します。 ローターを垂直に下に押して、セラミックドライブチップで閉じます。ドライブ先端の側面にある繊細なフィンに触れないようにしてください。 銀の永久マーカーを持つサファイアローターの下端の半分をマークし、分光計の内側のロータの回転を正確に監視できるように、ロータの下端の残りの半分を黒の永久マーカーでマークします。注:ロータのマーキングに欠陥がある場合、回転周波数の正確なカウントが防止され、安定した回転を実現できません。マーカーは凍結ローターに書き込まず、ローターの温暖化はサンプルの完全性を損なうので、凍結前にローターをマーキングすることは重要なステップです。 3.2mmサファイアローター内の細胞の凍結保存。 ティッシュまたはペーパータオルで作られたクッションを蓋の下と極低温バイアルの底に置いてください( 材料表を参照)。メモ:ティッシュペーパーは、ロータマーキングを極低温バイアルの側面にぶつかった場合の損傷から保護します。 3.2 mm サファイアローターを、極低温バイアルの底面に目印の端が付いたティッシュペーパーで埋め込まれた極低温バイアルに入れます。 低温バイアルを制御速度(-1 °C/min)冷却容器に入れ、最低3時間で-80°Cの冷凍庫に入れ、ローターをゆっくり凍結します。 凍結ローターを含む極低温バイアルを液体窒素貯蔵に移します。 3. NMR分光計への凍結試料の低温転写 凍結したサンプルをNMR施設に輸送します。 凍結ローターを含む極低温バイアルを、液体窒素を充填した小さなデュワーに移し、NMR施設に輸送します。 液体窒素浴場への凍結ローターの移動。 乾燥した、熱断熱された広口泡のデュワーを500 mL – 1 Lの液体窒素で満たします。 ローターを極低温バイアルから液体窒素で満たされた広口泡デュワーに移します。 手に移り変えるデュワーから極低温バイアルを取り、液体窒素の表面のすぐ上に保持して大気から保護します。 口を少し下向きにして極低温バイアルを保持しながら、キャップを緩め、ローターを液体窒素浴中にスライドさせます。注:キャップが緩めなくなると、ロータはロータに結露が集まらないように、極低温バイアルから液体窒素浴に素早く(1秒以下)落下する必要があります。液体窒素の蒸発は、広口発泡のデュワーに「窒素雲」を形成し、液体窒素に沈める前にローター上の結露を防ぎます。ローターを空気に長時間曝すと、ローターの壁に水分が凝縮し、氷に再凝縮する可能性があります。 ローターをNMRサンプルキャッチャーに極低温で移動。 液体窒素浴中に1.5mLマイクロ遠心分離チューブを浸してプレチルします。チューブを閉じないでください。メモ:マイクロ遠心チューブに移す前にローターを点検してください。ピンセットを使用して、ローターを液体窒素の表面のすぐ下に保持し、ローターのマーキングがそのままであり、壁に氷の堆積物が形成されていないこと、およびドライブ先端がそのままであることを確認します。ローター壁の氷の結晶堆積物は白い粉として現れます。ローターは、ドライブチップではなく、常にボディで保持するように注意してください。トゥイザーチップでローターのマーキングを引っ掻かないでください。 液体窒素浴の表面の下で、ピンセットを使用して、マイクロ遠心チューブの底に面したドライブチップとチューブの開口部に面したマーキングで、ローターをマイクロ遠心チューブに移します。注:液体窒素に浸かるか、ローターに触れる前に、必ずピンセットを乾燥してください。 ピンセットを使用して、ローターを含むチューブを液体窒素の下に首で保持します。 2つ目のピンセットを手にして、NMRサンプルキャッチャーを液体窒素浴中に沈め、マイクロ遠心チューブに対して鋭角に傾斜するように保持する準備をしてください。メモ:Oリングの凍結を避けるために、サンプルキャッチャーが液体窒素と接触する時間を最小限に抑えます。Oリングがフリーズすると、捕手を分光器に挿入することは非常に困難になります。 NMRサンプルキャッチャーからNMR分光器への極低温ローター転写注:このステップでは、クライオキャビネットを操作し、1人が液体窒素からプローブにサンプルを移す2人が必要です。 キャビネットの「EJECT」を押して、凍結キャビネットをイジェクションモードにします。注:吐出モードは大気の湿気の入り口を防ぐために、プローブから大気への高圧で乾燥した窒素ガスの流れをパージします。 ローターをNMRサンプルキャッチャーに移します。 液体窒素の表面の下にNMRサンプルキャッチャーの開いた端をマイクロ遠心分離管に挿入します。 マイクロ遠心チューブとNMRサンプルキャッチャーの両方を持ち上げて、ローターがサンプルキャッチャーに落ちるようにします。ローターがサンプルキャッチャーの縁に刺さった場合に備えて、NMRサンプルキャッチャーとマイクロ遠心チューブを振ります。 空のマイクロ遠心チューブをNMRサンプルキャッチャーの上に置いて、ローターを空気から保護します。 他の空のNMRサンプルキャッチャーをプローブから取り出し、床に置きます。 ローターを含むNMRサンプルキャッチャーをフリーハンドに移し、マイクロ遠心チューブを取り外し、すぐにプローブに挿入します。メモ:Oリングがフリーズすると、サンプルキャッチャーを締めるのが難しくなります。それが所定の位置にスライドするまで力を適用し続けます。 クライオキャビネットを操作している人に「EJECTを停止」と「INSERT」と合図します。メモ:挿入モードは、ロータをサンプルキャッチャーからプローブに導きます。 クライオキャビネットで制御される軸受と駆動流圧を調整して、目的の回転速度(例えば12kHz)までサンプルを回転させます。(例えば、軸受ガスを~200mBarに直ちに増やし、駆動ガスを10mBarに増やします。サンプルが回転したら、ベアリングガスを1000 mBarに上げ、ガスを200 mBarに駆動します。回転が安定すると、ベアリングを2400 mBarに増やし、数分間で駆動ガスを200 mBarから1700 mBarに増やします。VT冷却ガスは、約1070 L/hで一定です。注:マイクロ遠心チューブとNMRサンプルキャッチャーを液体窒素バスから持ち上げる場合は、マイクロ遠心チューブの中にローターを取り囲むのに十分な液体窒素があることを確認してください。ローターをNMRサンプルキャッチャーに移してから、NMRサンプルキャッチャーを分光器に挿入する時間を最小限に抑えます。3.4のすべての手順は30 s以内で完了する必要があります。 4. NMR分光器からの試料の極低温除去 液体窒素浴と極低温バイアルの調製 広い口の泡のデュワーに液体窒素の500 mL – 1 Lを注ぎ、分光器の下にバスを置きます。 極低温バイアルを事前に冷却します。液体窒素浴中にティッシュペーパーを含む空の極低温バイアルを水没させる。 ローターのプローブから低温バイアルへの極低温移動 駆動ガスとベアリングガスの流れを下げて回転速度を0 kHzに下げ、射出モードに切り替えてロータを排出します。 放出モードをオンにしたまま、サンプルキャッチャーをプローブから取り出し、ローターを液体窒素を含む広口泡デュワーに直接ドロップします。 事前に冷やしたピンセットを使用して、ローターを液体窒素の表面の下で冷やされた極低温バイアルに移します。 極低温バイアルをキャップします。極低温バイアルキャップを液体窒素に浸してプレチルします。ローターと液体窒素を含む極低温バイアルを浴槽から取り出し、チューブにプレチルキャップをキャップします。気化窒素を安全に放出できるようにキャップを締めないでください。 極低温バイアルを液体窒素に再び浸す。サンプルは、より長期間の液体窒素貯蔵に移されるか、または更なる分析のためにすぐに開梱することができる。 5. ロータと生存率の測定を開梱する ローターの開梱と実行可能性の測定 プレウォーム血清フリー培地(DMEM)またはPBS〜37°C。 液体窒素からローターを取り除きます。ドライブチップとシリコンプラグを取り外します。注:サファイアは優れた熱伝導体です。熱伝達は細胞の生存率を損なう局所的な凍結融解イベントを引き起こす可能性があるため、指でローターに触れないようにしてください。 生存率の測定 ローターの凍結した細胞ペレットに20μLの温かい培地を加え、細胞を再懸濁させます。ピペットでサスペンションを取り外し、100 μLのメディアで撹拌します。 10 μLのセル懸濁液を取り除き、0.4%のトリパンブルー溶液(v/v)の等体積で混ぜます。室温で30~1分間インキュベートします。 自動化されたセルカウンターを使用して生存率を測定します。