מוצג כאן פרוטוקול להעברה קריוגנית של דגימות קפואות לזווית הקסם הדינמית של הקיטוב הגרעיני (DNP) המסתובב (MAS) גשושית תהודה מגנטית גרעינית (NMR). הפרוטוקול כולל הוראות לאחסון רוטור לפני הניסוי וכיוונים למדידות כדאיות לפני ואחרי הניסוי.
קיטוב גרעיני דינמי (DNP) יכול להגביר באופן דרמטי את הרגישות של ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (MAS) של זווית הקסם (MAS). רווחי רגישות אלה עולים ככל שהטמפרטורות יורדות וגדולות מספיק כדי לאפשר את חקר המולקולות בריכוזים נמוכים מאוד בטמפרטורות ההפעלה (~ 100 K) של רוב ספקטרומטרי NMR המסחריים המצוידים ב- DNP. זה מוביל לאפשרות של ביולוגיה מבנית בתא על תאים cryopreserved עבור macromolecules ברמות אנדוגני שלהם בסביבות המקומיות שלהם. עם זאת, שיעורי ההקפאה הנדרשים עבור cryopreservation הסלולר הם חריגה במהלך טיפול מדגם טיפוסי עבור DNP MAS NMR וזה גורם לאובדן שלמות התא ואת הכדאיות. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט להכנת והעברה קריוגנית של מדגם קפוא של תאי יונקים לספקטרומטר NMR MAS.
כניסתו של קיטוב גרעיני דינמי עבור זווית קסם ספינינג ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית יכול להגביר את הרגישות של MAS NMR על ידי מספר סדרי גודל. זה איפשר זיהוי של ביומולקולים בריכוזים הפיזיולוגיים שלהם או בסמוך להם. DNP יכול ומספק את הרגישות הנדרשת כדי לזהות חלבון שכותרתו איזוטופית בריכוזים אנדוגניים (~ 1 μM) בסביבה ביולוגית מורכבת1. מכיוון שישנם פרוטוקולים מבוססים היטב להכניס מולקולות בעלות תווית איזוטופית לתאי יונקים ללא תווית מבלי להשפיע על הכדאיות שלהם, זה פותח את האפשרות לחקור ביומולקולות מועשרות איזוטופית ברמות האנדוגניות שלהם בסביבה הטבעית שלהם. יתר על כן, כי שיפורי DNP יעילים יותר בטמפרטורות נמוכות יותר2,3,4, הטמפרטורות הניסיוניות עבור DNP MAS NMR ליישר בצורה מסודרת עם אלה הנדרשים לאחסון לטווח ארוך של תאים יונקים קיימא5. עם זאת, השיטה הקונבנציונלית של העברת מדגם לתוך ספקטרומטר DNP MAS NMR נושאת אותו לשיעורי תנודות טמפרטורה כי לקרוע תאים יונקים.
ניסויי MAS NMR דורשים כי המדגם יסתובב על זווית הקסם בתדרים השווים או גדולים יותר מגודל האינטראקציה האניסוטרופית כדי שהיא תהיה ממוצעת לאפס, בדרך כלל לפחות 4 kHz ולעתים קרובות הרבה יותר גבוה6,7,8,9. דגימות, אם כן, ארוזות לתוך רוטורים שיש להם קצה פין המשמש להנעת הסיבוב של הרוטור על ידי זרם של גז ויש להם סימן בקצה השני, כך שתדר הסיבוב יכול להיות במעקב על ידי טכומטר. העברת מדגם עבור רוב מכשירי ה- MAS NMR מתבצעת על ידי הזרקת הרוטור מבחוץ של המכשיר לתוך הסטטור בסוף הבדיקה NMR עם זרם של אוויר יבש או גז חנקן. לאחר שהרוטור מגיע לסטטור, שמחזיק את הרוטור בזווית הקסם, סיבוב הדגימה מונע על ידי מנגנון טורבינת אוויר. נחלים נפרדים של תמיכה בגז, להניע ולשלוט בטמפרטורה של הרוטור. החדרת רוטור לספקטרומטר NMR והשגת ספינינג MAS יציב דורשת קצות כונן במכונה דק ושליטה הדוקה בטמפרטורה ובלחץ של זרמי הגז הנפרדים. למרות דרישות טכניות אלה, החדרה והשגת MAS יציבה הם אוטומטיים במידה רבה עבור בדיקות מס NMR מסחרי עבור יישומי טמפרטורת החדר.
עם זאת, המצב מסובך יותר עבור יישומי טמפרטורה נמוכה. דגימות עבור יישומי טמפרטורה נמוכה מוכנסות בדרך כלל לספקטרומטר בטמפרטורת החדר ומוקפאות בסטטור. בדקה הראשונה, טמפרטורת המדגם יורדת במהירות (> −100 °C /min) וטמפרטורת המערכת דורשת מספר דקות כדי שישוות. בגלל יחסי הגומלין של טמפרטורה ולחץ, החדרה והתקרבות של MAS הרצוי מטופלים לעתים קרובות באופן ידני עבור יישומים בטמפרטורה נמוכה. למרות הדרישה להתערבות ידנית, הקפאת הרוטור בתוך המכשיר מועילה מכיוון שהיא ממזערת את כניסת המים והעיבוי לתוך הגשושית, שהיא קריטית לספינינג מוצלח. לא רק עיבוי והצטברות קרח מהסביבה לחות לחסום קווי גז, עיבוי, או כפור על הרוטור עצמו יכול למנוע באופן מכני MAS. לכן, דגימות עבור טמפרטורה נמוכה MAS NMR קפואים בדרך כלל בתוך המכשיר בשיעורים העולים על -100 °C /min.
תאי יונקים יכולים לשמור על שלמותם באמצעות מחזור הפשרת קיפאון אם הקירור איטי5,10,11,12, בקצב שווה או איטי יותר מ 1 °C /min. לחלופין, תאים גם שומרים על שלמותם אם קצב הקירור הוא אולטרה מהיר13,14,15, בקצב מהיר יותר מ 10 °C(4 °F/ min). המחירים ביניים לשני קיצוניים אלה לקרוע ולהרוג תאים יונקים עקב היווצרות גבישי קרח הן בתוך ומחוץ לתאים, אפילו בנוכחות סוכנים קריוגננים16. שיעורי הקירור לדוגמה עבור רוטור טמפרטורת החדר בתוך בדיקה מקוררת מראש נופלים בין שני הקצוות האלה, ובכך לחקור תאי יונקים בריוגניים שהשתמרו באופן קריוגניים, יש להקפיא דגימות לפני המעבר למכשיר ולהעביר אותן למכשיר ללא תנודות טמפרטורה שעלולות לפגוע במדגם או הצטברות של כפור על הרוטור שיכולים למנוע מהרוטור להסתובב. הפרוטוקול מתאר שיטה להכנסת רוטור ללא כפור מקורר מראש למערכת MAS NMR קריוגנית לחקר דגימות תאי יונקים שלמים שהשתמרו באופן קריוגני. העברת הדגימה הקריוגנית המתוארת כאן פותחה לאפיון NMR של תאים שלמים קיימא. עם זאת, הוא חל על כל מערכת שבה תנודות טמפרטורה עלולות לסכן את שלמות המדגם. זה כולל כל מגוון של מערכות מורכבות, כגון הקפאת תגובות מרווה לאפיון כימי ומבני של תגובה לכודה ביניים17,18, אנזימולוגיה19,20 או חלבון מתקפל21,22.
ההעברה הקריוגנית של דגימות קפואות לספקטרומטר NMR מצליחה לשמר את הכדאיות של תאי יונקים קפואים באמצעות רכישת נתוני NMR. ההצלחה של מתודולוגיה זו מודגמת במדידות הכדאיות של לפני ולאחר MAS NMR. גישה זו היא מוצלחת וכליל לכל מערכת שבה תנודות טמפרטורה עלולות לסכן את שלמות המדגם. הפרוטוקול המוצג כעת מבוצע עם קו התא HEK 293. מכיוון שתנאי ההקפאה של קווי תאים רבים של יונקים דומים מאוד, סביר להניח כי התנאים המדווחים כאן ניתנים לתרגום למערכות תאיות אחרות; עם זאת, הם עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת של קריו-הגנה, נפחי דגימה ושיעורי הקפאה כדי להשיג את אותן תוצאות.
מתודולוגיה זו ניתן לשפר על ידי פירוק הרוטור מהר יותר לאחר ניסוי NMR. שלב זה הוא כעת תת אופטימלי וביצועו משפיע על הכדאיות של התאים. לפני שניתן יהיה לחבר מחדש את התאים במדיה, יש להסיר את קצה הכונן ואת תקע הסיליקון מהרוטור. המדגם מפשיר באופן לא אחיד כאשר הרוטור מוחזק במהלך הסרת קצה הכונן ותקע הסיליקון כך זמני טיפול רוטור קצרים כל כך לגרום viabilitiesות גבוהות יותר. פיתוח מחזיקי רוטור או כלים אחרים כדי להקל על הפשרה אחידה והסרה מהירה של קצה הכונן ותקע הסיליקון יסייעו להפוך את הערכת הכדאיות שלאחר NMR למדויקת יותר.
הגישה לטעינת דגימה קריוגנית המתוארת במאמר זה מוגבלת לבדיקות NMR התומכות בהחדרת דגימה ופלטה עם הגשוש במקום בשעמום של מגנט NMR. בעוד הכנסה ופלטה של מדגם חיצוניות סטנדרטיות עבור מערכות DNP מסחריות, בדיקות מותאמות אישית לא תמיד יש אפשרות זו. כמו כן, גישה זו לטעינת מדגם קריוגני עשויה לדרוש שינוי מסוים עבור בדיקות NMR שנבנו כדי להיות תואמות לרוטורים בגודל שונה. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לרוטורים 3.2 מ”מ ועשוי לדרוש שינוי אם הקוטר החיצוני של לוכד הדגימה עולה על הקוטר הפנימי של צינור microcentrifuge (למשל, שלב 3.4.2).
עם היישום של DNP ל- MAS NMR, כעת ניתן לזהות חלבונים וביומולקולים אחרים בריכוזים פיזיולוגיים אנדוגניים24,25,26. זה פותח את האפשרות של לימוד biomolecules בתוך הסביבות המקומיות שלהם. שמירה על שלמות התאים והקיימות לאורך כל הניסוי צפויה להיות קריטית בחיבור התוצאות הניסיוניות של הספקטרוסקופיה לתופעות ביולוגיות. הקפאה בלתי מבוקרת של דגימות המכילות חלבונים מטוהרים או ליסאטים תאיים אינה פוגעת בדרך כלל באיכות המדגם7,27, אם כי יש כמה אינדיקציות לכך שקצב ההקפאה עשוי להיות משתנה חשוב אפילו במערכות מטוהרות28. עם זאת, דגימות של תאי יונקים צריכות להיות קפואות בקצב מבוקר אם שמירה על שלמות התאים ואת הכדאיות חשובה לפרשנות. כאן אנו מציגים פרוטוקול להקפאה והעברת דגימות קפואות של תאי יונקים למכשיר DNP MAS NMR מקורר מראש, המונע תנודות טמפרטורה שעלולות להזיק ותומך במדידה על תאים בת קיימא.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון לחקר הסרטן בטקסס [RR150076], הקרן הלאומית למדע [1751174]; המכונים הלאומיים לבריאות [NS-111236], קרן וולש [1-1923-20170325]; קרן לופה מרצ’יסון, קרן טד נאש לחיים ארוכים וקרן הקרבה (תוכנית חוקרי סירל) ל- K.K.F.
0.4% Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | |
100 mm cell culture dish | Thomas Scientific | 430167 | |
150 mm cell culture dish | Nunc | 157150 | |
3.2 mm sapphire rotor | Bruker | ||
45 ° angled forceps | Hampton Research | HR4-859 | |
AMUPol | Cortecnet | C010P005 | |
Black and Silver marker | Sharpie | ||
Cap removing tool | Bruker ? | ||
Cell culture grade water | HyClone | SH30529.03 | |
Ceramic cap | Bruker | ||
CoolCell | Corning/ Biocision | UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion) | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10288 | |
Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Cryogen tubes | Nalgene | 03-337-7Y | |
d8-glycerol | Aldrich | 447498 | |
Deuterium oxide, 99.8 % atom D | Aldrich | 756822-1 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
DNP NMR system with 1.7 T cryogen free gyrotron | Bruker | ||
Foam dewar | Spearlab | FD-800 | |
Kimwipes | Kimwipes | ||
Packaging tool | Bruker ? | ||
Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
Powdered PBS | VWR | VWRRV0780 | |
Protonated PBS | Gibco | 10010-023 | |
Silicon plug | Bruker | ||
Standard Vessel forceps | |||
Tryp-L | Gibco | 12605010 |