Cryogene monster laden in een magische hoek spinnen nucleaire magnetische resonantie spectrometer die cellulaire levensvatbaarheid behoudt

1. Cultuur en cryoprotectie van zoogdiercellen Kweek en oogsten van zoogdiercellen Ontdooi een aliquot bevroren menselijke embryonale niercellen (HEK 293). Kweek HEK 293 cellen in groeimedia (bijv. DMEM met 10% foetale runderserum en 1% Pen-Strep) bij 37 °C met 5% CO2 in 100 mm platen gedurende twee tot drie passages (7-10 dagen). Splits de cellen en cultuur in een plaat van 150 mm totdat de cellen 90-95% samenvloeiing bereiken.OPMERKING: Een plaat van 150 mm bij > 90% samenvloeiing volstaat om twee saffierrotors met een diameter van 3,2 mm te vullen. Oogst cellen met 4 ml trypsine (zie tabel met materialen)en 10 ml media. Breng de suspensie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur over op een steriele conische 15 ml en centrifugeer bij 673 x g (1000 tpm). Verwijder het supernatant. Was de celkorrel met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,4, −CaCl2, −MgCl2). Cryoprotectie van cellen Verzamel een celkorrel van 50 μL in een microcentrifugebuis. Bereid een mengsel van 50 μL PBS en 18 μL glycerol in een aparte buis. Meng de 50 μL celkorrel voorzichtig met 68 μL glycerol-PBS mengsel door het glycerol-PBS mengsel aan de bovenkant van de pellet toe te voegen en de pellet opnieuw te gebruiken door zachtjes op de zijkant van de buis te tikken totdat er geen klontjes overblijven.OPMERKING: Zachte pipetten kunnen ook worden gebruikt om de cel te resuspenderen, maar zorg ervoor dat de cellulaire integriteit niet in het gedrang komt. 2. Cryopreservatie van zoogdiercellen in een NMR-rotor Overdracht van cellen in een saffierrotor van 3,2 mm. Om een trechter te maken, snijdt u een pipetpunt van 200 μL en steekt u het smalle uiteinde van de gesneden pipetpunt in de 3,2 mm rotor. Breng de cellen over in de trechter die op de rotor zit. Plaats de rotor samen met de trechter in een microcentrifugebuis en pellet de cellen in de bodem van de rotor door centrifugeren op 673 x g gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en eventueel overtollig monster uit de rotor. Herhaal deze twee stappen totdat de rotor volledig vol zit met de cellen.OPMERKING: Bepaal eventueel de cellulaire levensvatbaarheid van het monster voordat het wordt bevriest. Resuspend 10 μL van de overtollige celkorrel in 100 μL FBS-vrije DMEM. Meng 10 μL van de suspensie met 0,4% trypan blauwe oplossing en beoordeel onmiddellijk de levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller. Gebruik alleen FBS-vrije media om cellen te verdunnen, omdat serum de blauwe kleuring van de trypan verstoort. Sluit de rotor af met een siliconenplug met behulp van in de handel verkrijgbaar verpakkingsgereedschap. Sluit de rotor met een keramische aandrijfpunt door deze verticaal naar beneden te drukken. Raak de delicate vinnen aan de zijkant van de aandrijftip niet aan. Markeer de helft van de onderrand van de saffierrotor met een zilveren permanente markering en de andere helft van de onderrand van de rotor met een zwarte permanente markering om nauwkeurige bewaking van het draaien van de rotor in de spectrometer mogelijk te maken.OPMERKING: Onvolkomenheden in de markering van de rotor voorkomen een nauwkeurige telling van de spinfrequentie, wat resulteert in het niet bereiken van stabiel spinnen. Omdat markeringen niet op een bevroren rotor schrijven en rotorverwarming de monsterintegriteit in gevaar brengt, is het markeren van de rotor vóór het invriezen een kritieke stap. Cryopreservatie van cellen in een saffierrotor van 3,2 mm. Plaats een kussen gemaakt van een stuk tissue of keukenpapier onder het deksel en aan de onderkant van de cryogene flacon (zie tabel met materialen).OPMERKING: Het tissuepapier beschermt de rotormarkering tegen beschadigingen door stoten tegen de zijkanten van cryogene flacons. Plaats de saffierrotor van 3,2 mm in de cryogene flacon, opgevuld met het tissuepapier met gemarkeerd uiteinde naar de onderkant van de cryogene flacon. Vries de rotor langzaam in door de cryogene flacon in de koelcontainer met gecontroleerde snelheid (-1 °C/min) te plaatsen en plaats de container minimaal 3 uur in de vriezer van -80 °C. Breng de cryogene flacon met de bevroren rotor over in vloeibare stikstofopslag. 3. Cryogene overdracht van een bevroren monster in de NMR-spectrometer Transporteer het bevroren monster naar de NMR-faciliteit. Breng de cryogene flacon met de bevroren rotor over in een kleine dewar gevuld met vloeibare stikstof voor transport naar de NMR-faciliteit. Overdracht van bevroren rotor naar het vloeibare stikstofbad. Vul een droog, thermisch geïsoleerd breed mondschuim met 500 ml – 1 L vloeibare stikstof. Breng de rotor van de cryogene flacon over in het brede mondschuim met vloeibare stikstof. Neem de cryogene flacon uit de transferdewar in de hand en houd deze net boven het oppervlak van de vloeibare stikstof om deze tegen de atmosfeer te beschermen. Terwijl u de cryogene flacon vasthoudt terwijl de mond iets naar beneden wijst, schroeft u de dop los en laat u de rotor in het vloeibare stikstofbad glijden.OPMERKING: Zodra de dop is losgeschroefd, moet de rotor snel (minder dan 1 seconde) van de cryogene flacon in het vloeibare stikstofbad vallen om te voorkomen dat condensatie zich op de rotor verzamelt. De verdamping van vloeibare stikstof vormt een “stikstofwolk” in het brede mondschuim dewar en voorkomt condensatie op de rotor voordat deze wordt ondergedompeld in de vloeibare stikstof. Langere blootstelling van de rotor aan lucht kan leiden tot condensatie van vocht op rotorwanden die opnieuw condenseren in ijs. Cryogene overdracht van rotor naar NMR monstervanger. Prechill een 1,5 ml microcentrifugebuis door deze onder te dompelen in het vloeibare stikstofbad. Sluit de buis niet.OPMERKING: Inspecteer de rotor voordat u deze in de microcentrifugebuis overzet. Houd met een pincet de rotor net onder het oppervlak van de vloeibare stikstof en controleer of de rotormarkeringen intact zijn, of er geen ijsafzettingen op de wanden zijn gevormd en of de aandrijfpunt intact is. IJskristalafzettingen op de rotorwanden verschijnen als wit poeder. Zorg ervoor dat u de rotor altijd bij zijn lichaam houdt en niet bij de aandrijftip. Krab de markering niet van de rotor met de pincetpunten. Gebruik onder het oppervlak van het vloeibare stikstofbad een pincet om de rotor in de microcentrifugebuis over te brengen met de aandrijfpunt naar de bodem van de microcentrifugebuis en de markeringen naar de opening van de buis.OPMERKING: Droog het pincet altijd voordat u het onderdompelt in vloeibare stikstof of de rotor aanraakt. Houd met een pincet de buis met de rotor onder vloeibare stikstof bij de nek. Met een tweede pincet in de hand, bereid u voor om de NMR-monstervanger onder te dompelen in het vloeibare stikstofbad en deze zo vast te houden dat deze onder een scherpe hoek ten opzichte van de microcentrifugebuis staat.OPMERKING: Minimaliseer de tijd dat de monstervanger in contact komt met de vloeibare stikstof om bevriezing van de O-ring te voorkomen. Als de O-ring bevriest, zal het erg moeilijk zijn om de vanger in de spectrometer te plaatsen. Cryogene rotoroverdracht van de NMR-monstervanger naar de NMR-spectrometerOPMERKING: Voor deze stap zijn twee personen nodig, één om de cryocabinet te bedienen en één om het monster van de vloeibare stikstof in de sonde over te brengen. Plaats de cryocabinet in de uitwerpmodus door op ‘EJECT’ op de kast te drukken.OPMERKING: De uitwerpmodus zuivert de droge en koude stikstofgasstroom onder hoge druk van de sonde naar de atmosfeer om de intrede van atmosferisch vocht te voorkomen. Breng de rotor over in de NMR-monstervanger. Steek het open uiteinde van de NMR-monstervanger in de microcentrifugebuis terwijl deze zich nog onder het oppervlak van de vloeibare stikstof bevindt. Til zowel de microcentrifugebuis als de NMR-monstervanger op zodat de rotor in de monstervanger kan vallen. Schud de NMR-monstervanger en de microcentrifugebuis voor het geval de rotor op de rand van de monstervanger vastzit. Laat de lege microcentrifugebuis bovenop de NMR-monstervanger om de rotor tegen lucht te beschermen. Verwijder de andere lege NMR-monstervanger uit de sonde en leg deze op de grond. Breng de NMR-monstervanger met de rotor over naar uw vrije hand, verwijder de microcentrifugebuis en plaats deze onmiddellijk in de sonde.OPMERKING: Als de O-ring bevriest, zal het moeilijk zijn om de monstervanger vast te draaien. Blijf kracht uitoefenen totdat deze op zijn plaats glijdt. Geef de persoon die de cryocabinet bedient een seintje voor ‘STOP EJECT’ en ‘INSERT’.OPMERKING: De insteekmodus leidt de rotor van de monstervanger naar de sonde. Draai het monster op de gewenste draaisnelheid (bijv. 12 kHz) door de lager- en rijstroomdruk aan te passen die door de cryocabinet wordt geregeld. (bijv. Verhoog het lagergas onmiddellijk tot ~200 mBar en het aandrijfgas tot 10 mBar. Zodra het monster draait, verhoogt u het lagergas tot 1000 mBar en drijft u het gas naar 200 mBar. Als het spinnen stabiliseert, verhoogt u het lager tot 2400 mBar en verhoogt u vervolgens het aandrijfgas van 200 mBar naar 1700 mBar over meerdere minuten. VT koelgas is constant bij ~1070 L/h.)OPMERKING: Wanneer u de microcentrifugebuis en NMR-monstervanger uit het vloeibare stikstofbad tilt, moet u ervoor zorgen dat de microcentrifugebuis voldoende vloeibare stikstof in zich heeft om de rotor te omringen. Minimaliseer de tijd tussen het overbrengen van de rotor in de NMR-monstervanger en het plaatsen van de NMR-monstervanger in de spectrometer. Alle stappen in 3.4 moeten binnen 30 s worden voltooid. 4. Cryogene verwijdering van het monster uit de NMR-spectrometer Bereiding van het vloeibare stikstofbad en de cryogene flacon Giet 500 ml – 1 L vloeibare stikstof in de dewar van breed mondschuim en plaats het bad onder de spectrometer. Koel de cryogene flacon voor. Dompel de lege cryogene flacon met een stuk tissuepapier onder in het vloeibare stikstofbad. Cryogene overdracht van rotor van sonde naar cryogene flacon Verminder de draaisnelheid tot 0 kHz door de rij- en lagergasstroom naar beneden te halen en de rotor uit te werpen door over te schakelen naar de uitwerpmodus. Houd de uitwerpmodus aan, verwijder de monstervanger uit de sonde, laat de rotor rechtstreeks in de dewar van breed mondschuim vallen die vloeibare stikstof bevat. Breng de rotor met een voorgekoeld pincet over in een voorgekoeld cryogene flacon onder het oppervlak van de vloeibare stikstof. Sluit de cryogene flacon af. Prechill de cryogene flacon dop door het onder te dompelen in vloeibare stikstof. Verwijder de cryogene flacon met de rotor en vloeibare stikstof uit het bad en sluit de buis af met een voorgekneed dop. Draai de dop niet vast zodat er veilig verdampende stikstof vrijkomt. Dompel de cryogene flacon opnieuw onder in vloeibare stikstof. Het monster kan worden overgebracht naar opslag van vloeibare stikstof op langere termijn of onmiddellijk worden uitgepakt voor verdere analyse. 5. Uitpakken van rotor- en levensvatbaarheidsmetingen Rotor uitpakken en levensvatbaarheid meten Pre-warme serumvrije media (DMEM) of PBS tot 37 °C. Verwijder de rotor van vloeibare stikstof. Verwijder de aandrijftip en de siliconenstekker.OPMERKING: Saffier is een uitstekende warmtegeleider. Raak de rotor niet aan met uw vingers, omdat warmteoverdracht lokale bevriezings-dooigebeurtenissen kan veroorzaken die de cellulaire levensvatbaarheid in gevaar brengen. Levensvatbaarheid meten Voeg 20 μL warme media toe aan de bevroren celkorrel in de rotor en resuspend cellen. Verwijder de suspensie met een pipet en meng de suspensie met 100 μL media. Verwijder 10 μL celsuspensie en meng met een gelijk volume van 0,4% trypan blauwe oplossing (v/v). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 s tot 1 min. Meet de levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller.