تحميل عينة المبردة في زاوية سحرية الغزل مطياف الرنين المغناطيسي النووي الذي يحافظ على الجدوى الخلوية
Summary
يقدم هنا بروتوكول لنقل العينات المجمدة المبردة إلى مسبار الرنين المغناطيسي النووي الديناميكي للاستقطاب النووي (DNP) الذي يدور (MAS). ويتضمن البروتوكول توجيهات لتخزين الدوار قبل التجربة واتجاهات لقياسات الجدوى قبل وبعد التجربة.
Abstract
يمكن أن يزيد الاستقطاب النووي الديناميكي (DNP) بشكل كبير من حساسية التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (MAS) للزاوية السحرية. تزداد مكاسب الحساسية هذه مع انخفاض درجات الحرارة وهي كبيرة بما يكفي لتمكين دراسة الجزيئات بتركيزات منخفضة جدا في درجات حرارة التشغيل (~ 100 K) لمعظم مطياف NMR التجاري المجهز ب DNP. وهذا يؤدي إلى إمكانية البيولوجيا الهيكلية داخل الخلية على الخلايا المبردة للجزيئات الكبيرة في مستوياتها الذاتية في بيئاتها الأصلية. ومع ذلك، يتم تجاوز معدلات التجميد المطلوبة لالتبريد الخلوي أثناء معالجة العينة النموذجية ل DNP MAS NMR وهذا يؤدي إلى فقدان سلامة الخلوية وقابليتها للحياة. توضح هذه المقالة بروتوكول مفصل لإعداد ونقل عينة مجمدة من خلايا الثدييات إلى مطياف MAS NMR.
Introduction
ويمكن لإدخال الاستقطاب النووي الديناميكي للزاوية السحرية التي تدور حول التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي أن يزيد من حساسية التحليل بالرنين المغناطيسي النووي (MAS NMR) بعدة أوامر من الحجم. وقد مكن ذلك من الكشف عن الجزيئات الحيوية عند تركيزاتها الفسيولوجية أو بالقرب منها. DNP يمكن ولا توفر الحساسية اللازمة للكشف عن البروتين المسمى نظائريا في تركيزات الذاتية (~ 1 ميكرومتر) في البيئة البيولوجية المعقدة1. ولأن هناك بروتوكولات راسخة لإدخال جزيئات مسماة بالنظائر في خلايا الثدييات غير المسماة دون التأثير على قدرتها على البقاء، فإن هذا يفتح إمكانية دراسة الجزيئات الحيوية المخصبة بالنظائر عند مستوياتها الذاتية في بيئتها الأصلية. وعلاوة على ذلك، لأن التحسينات DNP هي أكثر كفاءة في درجات حرارة أقل2،3،4، ودرجات الحرارة التجريبية لDNP MAS NMR تتماشى بدقة مع تلك المطلوبة لتخزين طويل الأجل من خلايا الثدييات قابلة للحياة5. ومع ذلك ، فإن الطريقة التقليدية لنقل عينة إلى مطياف DNP MAS NMR تخضعها لمعدلات تقلب درجة الحرارة التي تمزق خلايا الثدييات.
تتطلب تجارب MAS NMR أن يتم تدوير العينة حول الزاوية السحرية بترددات تساوي أو تزيد عن حجم التفاعل النظيري بحيث يتم متوسطها إلى الصفر ، وعادة ما تكون على الأقل 4 كيلوهرتز وغالبا ما تكون أعلى بكثير6و7و8و9. ولذلك، فإن العينات معبأة في الدوارات التي تحتوي على طرف زعانف يستخدم لدفع دوران الدوار عن طريق تيار من الغاز ولها علامة في الطرف الآخر بحيث يمكن رصد تردد الدوران بواسطة مقياس سرعة الدوران. يتم نقل العينة لمعظم أجهزة MAS NMR عن طريق حقن الدوار من السطح الخارجي للأداة في الدعامة في نهاية مسبار NMR مع تيار من الهواء الجاف أو غاز النيتروجين. بعد أن يصل الدوار إلى الدعامة ، التي تحمل الدوار في الزاوية السحرية ، يتم دفع دوران العينة بواسطة آلية توربينات الهواء. تيارات منفصلة من دعم الغاز، ودفع والتحكم في درجة حرارة الدوار. يتطلب إدخال الدوار في مطياف NMR وتحقيق غزل MAS مستقر نصائح محرك الأقراص بدقة وتحكما محكما في درجة حرارة وضغط تيارات الغاز المنفصلة. على الرغم من هذه المطالب التقنية، يتم إدخال وتحقيق MAS مستقرة مؤتمتة إلى حد كبير للمسابير التجارية MAS NMR لتطبيقات درجة حرارة الغرفة.
ومع ذلك ، فإن الوضع أكثر تعقيدا بالنسبة للتطبيقات ذات درجات الحرارة المنخفضة. عادة ما يتم إدخال عينات لتطبيقات درجة الحرارة المنخفضة في المطياف في درجة حرارة الغرفة وتجميدها في الدعامة. في الدقيقة الأولى، تنخفض درجة حرارة العينة بسرعة (> –100 درجة مئوية /دقيقة) وتتطلب درجة حرارة النظام عدة دقائق للتوازن. بسبب التفاعل بين درجة الحرارة والضغط، غالبا ما يتم التعامل مع إدراج والاقتراب من ماس المطلوب يدويا لتطبيقات درجة الحرارة المنخفضة. على الرغم من الحاجة للتدخل اليدوي ، فإن تجميد الدوار داخل الجهاز مفيد لأنه يقلل من إدخال الماء والتكثيف في المسبار ، وهو أمر بالغ الأهمية لنجاح الغزل. ليس فقط يمكن للتكثيف والجليد تراكم من خطوط الغاز كتلة الرطوبة المحيطة، والتكثيف، أو الصقيع على الدوار نفسه يمكن أن تمنع ميكانيكيا ماس. وهكذا، عادة ما يتم تجميد عينات لانخفاض درجة الحرارة MAS NMR داخل الصك بمعدلات تتجاوز -100 درجة مئوية / دقيقة.
يمكن للخلايا الثديية الاحتفاظ بسلامتها من خلال دورة التجميد والذوبان إذا كان التبريدبطيئا5و10و11و12بمعدل يساوي أو أبطأ من 1 درجة مئوية / دقيقة. بدلا من ذلك تحتفظ الخلايا أيضا سلامتها إذا كان معدل التبريد فائقالسرعة 13،14،15، بمعدل أسرع من 104 درجة مئوية / دقيقة. معدلات وسيطة لهذين النقيضين تمزق وقتل خلايا الثدييات بسبب تشكيل الكريستال الجليد داخل وخارج الخلايا، حتى في وجود عوامل الصفن الجليدي16. تقع معدلات تبريد العينة الخاصة بدوار درجة حرارة الغرفة داخل مسبار تم تبريده مسبقا بين هذين النقيضين ، وبالتالي لدراسة خلايا الثدييات السليمة السليمة المحفوظة بالتبريد ، يجب تجميد العينات قبل نقلها إلى الجهاز ونقلها إلى الجهاز دون تقلبات في درجة الحرارة يمكن أن تضر بالعينة أو تراكم الصقيع على الدوار الذي يمكن أن يمنع الدوار من الدوران. يصف البروتوكول طريقة لإدراج الدوار الخالي من الصقيع والمبرد مسبقا في نظام MAS NMR المبرد لدراسة عينات خلايا الثدييات السليمة المحفوظة بالتبريد. تم تطوير نقل العينة المبردة الموصوفة هنا لتوصيف NMR للخلايا السليمة القابلة للحياة. ومع ذلك، فإنه ينطبق على أي نظام حيث تقلبات درجة الحرارة قد تهدد سلامة العينة. وهذا يشمل أي مجموعة متنوعة من النظم المعقدة، مثل تجميد التفاعلات المروية لتوصيف الكيميائية والهيكلية من وسيطة رد الفعل المحاصرين17،18، الأنزيمولوجيا19،20 أو البروتين للطي21،22.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد نجح نقل العينات المجمدة المبردة إلى مطياف NMR في الحفاظ على صلاحية خلايا الثدييات المجمدة من خلال الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي. ويتجلى نجاح هذه المنهجية في قياسات جدوى ما قبل وبعد MAS NMR. هذا النهج ناجح وقابل للتعميم على أي نظام حيث تقلبات درجة الحرارة قد تعرض سلامة العينة للخطر. يتم تنفيذ البروتوكول المعروض حاليا مع خط الخلية HEK 293. لأن ظروف حفظ التبريد للعديد من خطوط خلايا الثدييات متشابهة جدا، فمن المرجح أن الظروف المبلغ عنها هنا قابلة للترجمة إلى أنظمة خلوية أخرى. ومع ذلك، فإنها قد تتطلب تحسين مزيد من المبردات، وحجم العينة، ومعدلات التجميد لتحقيق نفس النتائج.
ويمكن تحسين هذه المنهجية عن طريق تفريغ الدوار أسرع تجربة ما بعد NMR. هذه الخطوة حاليا دون المستوى الأمثل وتنفيذها يؤثر على صلاحية الخلايا. قبل أن يمكن إعادة إنفاق الخلايا في الوسائط، يجب إزالة طرف محرك الأقراص وقابس السيليكون من الدوار. العينة يذوب بشكل غير متساو عندما يتم عقد الدوار أثناء إزالة طرف محرك الأقراص والمكونات السيليكون حتى أقصر أوقات التعامل مع الدوار يؤدي إلى ارتفاع viabilities. إن تطوير حاملات الدوار أو غيرها من الأدوات لتسهيل ذوبان الجليد الموحد والإزالة السريعة لطرف محرك الأقراص وقابس السيليكون سيساعد في جعل تقييم ما بعد NMR للقدرة على البقاء أكثر دقة.
يقتصر النهج المتبع لتحميل العينة المبردة الموصوفة في هذه المقالة على مسابير NMR التي تدعم إدخال العينة وإخراجها مع وجود المسبار في مضجر مغناطيس NMR. بينما إدراج العينة الخارجية وإخراج هو المعيار لأنظمة DNP التجارية، تحقيقات مخصصة لا يكون دائما هذا الخيار. أيضا، قد يتطلب هذا النهج لتحميل العينة المبردة بعض التعديل للمسابير NMR بنيت لتكون متوافقة مع الدوارات مختلفة الحجم. وقد تم تحسين هذا البروتوكول للدوار 3.2 ملم، وقد يتطلب التعديل إذا كان القطر الخارجي للعينة الماسك يتجاوز القطر الداخلي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق (مثل الخطوة 3.4.2).
مع تطبيق DNP على MAS NMR ، أصبح من الممكن الآن اكتشاف البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى بتركيزات فسيولوجية داخلية24و25و26. وهذا يفتح إمكانية دراسة الجزيئات الحيوية داخل بيئاتها الأصلية. ومن المرجح أن يكون الحفاظ على سلامة الخلوية وقابليتها للحياة طوال التجربة أمرا حاسما في ربط النتائج التجريبية للتنظير الطيفي بالظواهر البيولوجية. تجميد غير المنضبط من العينات التي تحتوي على البروتينات النقية أو اليسات الخلوية لا يعرض للخطر عادة جودة العينة7،27، على الرغم من أن هناك بعض المؤشرات على أن معدل التجمد قد يكون متغيرا هاما حتى في النظم المنقى28. ومع ذلك ، يجب تجميد عينات من خلايا الثدييات بمعدل مسيطر عليه إذا كان الحفاظ على سلامة الخلوية وقابليتها للحياة أمرا مهما للتفسير. هنا نقدم بروتوكولا لتجميد ونقل العينات المجمدة من خلايا الثدييات إلى أداة DNP MAS NMR المبردة مسبقا التي تتجنب تقلبات درجة الحرارة الضارة المحتملة وتدعم القياس على الخلايا القابلة للحياة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس [RR150076] ، والمؤسسة الوطنية للعلوم [1751174]؛ المعاهد الوطنية للصحة [NS-111236]، مؤسسة ويلش [1-1923-20170325]؛ مؤسسة لوب مورشيسون، ومؤسسة تيد ناش للحياة الطويلة، ومؤسسة القرابة (برنامج علماء سيرل) إلى K.K.F.
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | |
| 100 mm cell culture dish | Thomas Scientific | 430167 | |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | 157150 | |
| 3.2 mm sapphire rotor | Bruker | ||
| 45 ° angled forceps | Hampton Research | HR4-859 | |
| AMUPol | Cortecnet | C010P005 | |
| Black and Silver marker | Sharpie | ||
| Cap removing tool | Bruker ? | ||
| Cell culture grade water | HyClone | SH30529.03 | |
| Ceramic cap | Bruker | ||
| CoolCell | Corning/ Biocision | UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion) | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10288 | |
| Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Cryogen tubes | Nalgene | 03-337-7Y | |
| d8-glycerol | Aldrich | 447498 | |
| Deuterium oxide, 99.8 % atom D | Aldrich | 756822-1 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| DNP NMR system with 1.7 T cryogen free gyrotron | Bruker | ||
| Foam dewar | Spearlab | FD-800 | |
| Kimwipes | Kimwipes | ||
| Packaging tool | Bruker ? | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Powdered PBS | VWR | VWRRV0780 | |
| Protonated PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Silicon plug | Bruker | ||
| Standard Vessel forceps | |||
| Tryp-L | Gibco | 12605010 |
References
- Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu. Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).
- Hall, D. A., et al. Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution. Science. 276 (5314), 930-932 (1997).
- Akbey, &. #. 2. 2. 0. ;., Oschkinat, H. Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR. Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).
- Matsuki, Y., et al. Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K. Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).
- Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years. Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).
- Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer’s disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP. Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).
- Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
- Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems. ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).
- Jaudzems, K., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning. Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).
- Chaytor, J. L., et al. Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).
- Mazur, P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).
- Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide. Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).
- Bald, W. B. The relative merits of various cooling methods. Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).
- Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).
- Shi, M., et al. High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing. Scientific Reports. 5 (1), 17928 (2015).
- Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 1257, 3-19 (2015).
- Ramilo, C., et al. Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy. Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).
- Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717 (2019).
- Pievo, R., et al. A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions. Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).
- Cherepanov, A. V., de Vries, S. Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).
- Hu, K. N., Tycko, R. What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding. Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).
- Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance. Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).
- Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D. Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry. 64 (1), 1-26 (2013).
- Frederick, K. K., et al. Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus. Cell. 163 (3), 620-628 (2015).
- Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling. Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).
- Schlagnitweit, J., et al. Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy. ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).
- Debelouchina, G. T., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils. Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).
- Schmidt, T., et al. Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy. ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).
