مجهر القوة الذرية جنبا إلى جنب مع التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء كأداة للتحقيق في كيمياء البكتيريا الواحدة
Summary
القوة الذرية المجهرية الأشعة تحت الحمراء الطيف (AFM-IR) يوفر منصة قوية للدراسات البكتيرية، مما يتيح تحقيق دقة النانو. ويمكن إجراء كل من رسم خرائط للتغيرات دون الخلوية (على سبيل المثال، عند انقسام الخلايا) وكذلك الدراسات المقارنة للتركيب الكيميائي (على سبيل المثال، الناشئة عن مقاومة الأدوية) على مستوى خلية واحدة في البكتيريا.
Abstract
القوة الذرية المجهر بالأشعة تحت الحمراء الطيف (AFM-IR) هو تقنية الجمع بين الرواية، وتمكين التوصيف المتزامن للخصائص الفيزيائية والتركيب الكيميائي للعينة مع قرار نانومتر. من خلال الجمع بين AFM مع الأشعة تحت الحمراء ، يتم التغلب على الحد من الدقة المكانية للأشعة تحت الحمراء التقليدية ، مما يتيح تحقيق دقة من 20-100 نانومتر. وهذا يفتح الباب أمام مجموعة واسعة من التطبيقات الجديدة للأشعة تحت الحمراء نحو عينات التحقيق أصغر من عدة ميكرومترات، لم يكن من الممكن تحقيقها من قبل عن طريق المجهر الأشعة تحت الحمراء التقليدية. AFM-IR مناسب بشكل بارز للبحوث البكتيرية ، وتوفير كل من المعلومات الطيفية والمكانية على مستوى الخلية الواحدة وداخل الخلايا. وقد أدت المخاوف الصحية العالمية المتزايدة والتنبؤ المستقبلي غير المواتي فيما يتعلق بالعدوى البكتيرية، وخاصة التطور السريع لمقاومة مضادات الميكروبات، إلى خلق حاجة ملحة لأداة بحثية قادرة على التحقيق الظاهري على مستوى الخلية الواحدة ودون الخلوية. يوفر AFM-IR إمكانية تلبية هذه الحاجة، من خلال تمكين التوصيف التفصيلي للتركيب الكيميائي للبكتيريا الواحدة. هنا، ونحن نقدم بروتوكول كامل لإعداد العينات والحصول على البيانات من أطياف واحدة ورسم الخرائط طريقة، لتطبيق AFM-IR نحو الدراسات البكتيرية.
Introduction
البكتيريا هي الكائنات الحية prokaryotic خلية واحدة، التي تحدث في مختلف الأشكال والأحجام، وعادة في نطاق عدة مئات من نانومتر إلى ميكرومتر. وهي موجودة في مجموعة متنوعة من الموائل وهي ضرورية لوجود الحياة. داخل جسم الإنسان ، فإن غالبية البكتيريا الموجودة في الأمعاء غير ضارة والعديد منها مفيد في الواقع1. ومع ذلك ، فإن العديد من الأنواع البكتيرية هي مسببات الأمراض وتسبب مجموعة من الأمراض المعدية. يمكن أن تؤدي العدوى البكتيرية إلى تطور الإنتان وصدمة الإنتان: حالة تهدد الحياة ، ناتجة عن استجابة الجسم للعدوى2. الإنتان هو تهديد صحي رئيسي على مستوى العالم، مع ارتفاع معدل الانتشار في جميع أنحاء العالم ومعدلات الوفيات الشديدة. في عام 2017 وحده، تم تسجيل ما يقدر بنحو 50 مليون حالة تعفن الدم في جميع أنحاء العالم، مع 11 مليون منها أدت إلى الوفاة (حوالي 20٪)2. وعلاوة على ذلك، تبين أن انخفاض فرص بقاء المريض على قيد الحياة، بسبب تأخر العلاج، يحدث في الساعة3،4.
يتم علاج العدوى البكتيرية بالمضادات الحيوية. شدة العواقب المحتملة لالتهابات مجرى الدم البكتيرية (BSIs)، جنبا إلى جنب مع أهمية واضحة للبدء السريع في العلاج المضاد للميكروبات، تدفع إلى الحاجة إلى إدارة المضادات الحيوية الفورية. ومع ذلك ، حيث أن النهج التشخيصية الحالية المستخدمة في الممارسة السريرية (على سبيل المثال ، زراعة الدم) تتطلب وقتا طويلا نسبيا ، فإن إدارة المضادات الحيوية غالبا ما تحدث قبل تشخيص BSI الإيجابي5. ويؤدي هذا العامل إلى الإفراط في استخدام المضادات الحيوية على نطاق واسع، الأمر الذي يؤدي – إلى جانب الاستخدام المفرط للمضادات الحيوية في قطاعات أخرى مثلالزراعة– إلى خلق ضغط تطوري شديد نحو تطوير مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) 6و7. يعد معدل وفيات الرضع حاليا من أكثر القضايا الصحية العالمية إلحاحا7و8، وبحلول عام 2050، من المتوقع أن يصبح السبب الرئيسي للوفاة9. تطور المقاومة، جنبا إلى جنب مع انتشار سلالات AMR يحدث بوتيرة مثيرة للقلق7،8،9 ويتجاوز ، إلى حد بعيد ، معدل اكتشاف مضادات حيوية جديدة10. تظهر أنماط الظاهرية المقاومة الجديدة باستمرار في جميع أنحاء العالم ، في حين
البحث المكرس لفهم التغيرات المتعلقة بالبحث السنوي غالبا ما يكون بطيئا ومحدودا بالنهج المتاحة11. بالإضافة إلى ذلك، تركز الطرق الشائعة الاستخدام، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتسلسل الجينات بالكامل (WGS)، فقط على التغيرات الجينية. هذه ليست كافية للكشف عن آليات المقاومة11، مما دفع الحاجة الملحة لأداة بحثية تمكن من فهم التركيب الكيميائي للبكتيريا.
يوفر التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (IR) توصيفا جزيئيا للعينة وبالتالي فهو مرشح واعد للتحقيق البكتيري الظاهري. منذ تطبيقاتهمبكرة 12, برهنت حجم عظيمة أمثلة من إستعماله كان في الأدب13,14. وتشمل هذه تحديد القائم على phenotypic من البكتيريا على جنس15, الأنواع16, وسلالة17,18 مستوى. ومع ذلك ، يقتصر القرار المكاني للأشعة تحت الحمراء التقليدية على عدة ميكرون بسبب الحد الأقصى للدقة المكانية الحيود الطول الموجي19. وبما أن حجم غالبية البكتيريا يقع تحت هذا الحد (على سبيل المثال، المكورات العنقودية الذهبية ≈ قطرها 400 نانومتر)، فإن الأشعة تحت الحمراء التقليدية لا تنطبق على التحقيق على مستوى الخلية الواحدة أو داخل الخلية.
تم التغلب على قيود الدقة المكانية مؤخرا من خلال الجمع بين التحليل الطيفي للأشعة تحت الحمراء مع المجهر للقوة الذرية (AFM-IR). في هذه الحالة ، يتم الكشف عن امتصاص الأشعة تحت الحمراء بشكل غير مباشر ، من خلال التوسع الحراري للمادة19،20،21،22. باختصار، امتصاص الأشعة تحت الحمراء يؤدي إلى زيادة درجة الحرارة المحلية. ويمكن قياس هذا إما مباشرة23 أو من خلال قياس تذبذب التحقيق cantilever AFM، الناجمة عن دفعة القوة التي أنشأتها امتصاص الأشعة تحت الحمراء20،21. تمكن تقنية AFM-IR الجمعية من تحقيق دقة مكانية تقترب من 20 نانومتر ، مما يوفر معلومات متزامنة حول الخصائص الفيزيائية المحلية لعينة (AFM) وتكوينها الكيميائي (AFM-IR). ويمكن جمع كليهما، وأطياف واحدة من بقع مختارة ورسم خرائط لشدة قيم محددة في مجال مختار.
وبالنظر إلى الاستبانة المكانية القابلة للتحقيق من AFM-IR ، فمن الواضح أن هذه التقنية تفتح إمكانية التحقيق الكيميائي / phenotypic من خلية بكتيريا واحدة وتكوينها داخل الخلايا24. حتى الآن، تم عرض عدة أمثلة لتطبيق AFM-IR للبكتيريا المفردة في الأدب19،20،21،22،25،26،27،28. وتشمل هذه التحليل الطيفي واحد19،21،22 ورسم الخرائط في المستوى الفرعي19،22،25،26،27،28. على سبيل المثال، تم وصف القدرة على الكشف عن الحويصلات الدهنية داخل الخلايا27 والفيروسات28 داخل بكتيريا واحدة. هذه النتائج تثبت فائدة AFM-IR للدراسات النانوية من البكتيريا المفردة ومسببات الأمراض ذات الصلةسريريا 19.
ومن ثم، نقدم طريقة إعداد العينة وجمعها لبيانات AFM-IR لعينات بكتيرية متعددة الطبقات ومونو كلين وخلية واحدة. تم تطبيق البروتوكول الموصوف هنا لدراسة أنواع مختلفة من البكتيريا22 والتغيرات في تكوينها الكيميائي. على وجه الخصوص، تم التحقيق في التنمية في الجسم الحي من المقاومة فانكومايسين وdaptomycin غير قابلية في أزواج السريرية من S. أوريوس19. على حد سواء، ظهرت المقاومة المتقطعة فانكومايسين وdaptomycin عدم التعرض في S. أوريوس (فيزا و DpR) في الآونة الأخيرة نسبيا، في أعقاب زيادة استخدام وإدخال هذه المضادات الحيوية إلى العيادات، مما يشكل مشكلة طبية كبيرة. وعلاوة على ذلك، على وجه الخصوص، فإن آلية عدم قابلية دابتومايسين لا تزال بعيدة المنال، مما يعوق تطوير الأدوية البديلة19،29. ويركز البروتوكول المقدم على توفير أطياف موثوقة من البكتيريا المفردة من طراز AFM-IR، والتي يمكن تحليلها باستخدام مجموعة متنوعة من النهج الكيميائية، وفقا للأهداف التجريبية. كما يشمل نهج رسم الخرائط، الذي ينطبق على الدراسات داخل الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
10- إن فائدة التحليل الطيفي للأشعة تحت الحمراء في توصيف مجموعة واسعة من العينات البيولوجية في سياق تكوينها الكيميائي راسخة. على مدى العقد الماضي، ظهرت الأشعة تحت الحمراء الطيف كأداة واعدة للدراسات البكتيرية12،13،14،15،16،17. وهي تواصل جذب اهتمام كبير في مجال علم الأحياء المجهرية، باعتبارها واحدة من التقنيات القليلة التي تمكن من توصيف phenotypic من خلال التركيب الكيميائي. وفي هذا السياق، يكمن العيب الرئيسي في الفحص المجهري التقليدي للقوات البرية الدولية للنقل البري في الدقة المكانية المحدودة، مما يمنع الدراسات الفردية للبكتيريا التي أجريت على الخلايا ودون الخلوية. في الواقع ، فإن صغر حجم البكتيريا يمثل عائقا ليس فقط للأشعة تحت الحمراء ، ولكن بالنسبة للغالبية العظمى من التقنيات. وبالتالي، فإن أدوات البحث المتاحة للدراسات أحادية الخلية ودون الخلوية للبكتيريا محدودة بشكل كبير. ويمكن الجمع بين AFM والأشعة تحت الحمراء من التغلب على الحد من الدقة المكانية للتنظير الطيفي للأشعة تحت الحمراء، مما يوفر أداة جديدة للبحوث البكتيرية، قادرة على التحقيق النانوي في التركيب الكيميائي.
لا تقتصر هذه التقنية على دراسات الخلايا المفردة وتسمح للمرء بالتحقيق في مجموعة متنوعة من العينات ، تتراوح في سمكها. مما لا شك فيه، إعداد عينة نظيفة ودقيقة أمر بالغ الأهمية لتحقيق صور ذات جودة عالية. يوفر البروتوكول هنا طريقة لإعداد عينات متعددة الطبقات، أحادية الطبقة، و/ أو خلية واحدة من البكتيريا المختلفة (الشكل 1). تعتمد العينة المعدة على عدة عوامل ، بما في ذلك الحمل البكتيري الأولي ، وتخفيف ما بعد الغسيل بالإضافة إلى مزيد من التخفيف على الركيزة. كمية العينة التي تم الحصول عليها بعد تمييع الكريات المغسولة وقبل الترسب على الركيزة عادة ما يسمح بإعداد العديد من العينات. لذلك ، للحصول على التوزيع المطلوب للعينة على الركيزة ، غالبا ما يكون من المفيد إعداد سلسلة من العينات ، تتراوح في تخفيفها. بالنسبة للدراسات التي تهدف إلى جمع أطياف AFM-IR بدلا من التصوير دون الخلوي ، قد يكون تعديل كمية العينة (على سبيل المثال ، من الطبقة الأحادية إلى الطبقات المتعددة) مفيدا لزيادة كثافة الإشارة.
وثمة جانب هام آخر في إعداد العينات هو إزالة المخلفات المتوسطة بشكل مناسب. اعتمادا على أساليب زراعة العينة المختارة، يتم جمع العينة إما من وسط سائل أو من لوحة أجار. وفي كلتا الحالتين، يرجح أن تكون بقايا الكمية المتوسطة موجودة في العينة، وإن كان ذلك بدرجة أقل بكثير عند جمعها من ألواح أغار. بما أن وسائل الإعلام نمو البكتيريا تحتوي على وفرة من المكونات البيولوجية المختلفة، فمن الأهمية بمكان لضمان إزالة مناسبة من المتوسطة. نوصي بثلاثة يغسل مع المياه فائقة البور لعينات لوحة أجار وأربعة يغسل على الأقل للعينات التي تم جمعها من المتوسطة. يمكن زيادة عدد الغسيل ، إذا لزم الأمر . ومع ذلك، للمقارنة بين عينات مختلفة، من المهم أن يبقيه متسقة بين العينات. يستخدم البروتوكول الواضح الماء، بدلا من المذيبات مثل محلول الفوسفات العازل (PBS) أو المالحة. كل من برنامج تلفزيوني والمالحة تؤدي إلى تشكيل بلورات عند تجفيف الهواء، والتي يمكن أن تلحق الضرر البكتيريا. وبالإضافة إلى ذلك، كلاهما مصدر لعصابات الأشعة تحت الحمراء المكثفة، مع برنامج تلفزيوني، على وجه الخصوص، تحتوي على نطاقات متعددة في منطقة بصمات الأصابع. عدم القدرة على استخدام المالحة أو برنامج تلفزيوني ، يمثل حاليا قيدا هاما لهذه التقنية. عادة، استخدام الماء لغسل لا يسبب أي تأثير مدمر على البكتيريا. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر، وإذا أمكن، ينبغي أن يكون وقت التعرض للمياه محدودا. إذا كان بروتوكول إعداد العينة يحتاج إلى التوقف مؤقتا في مرحلة الغسيل ، فمن المستحسن ترك العينة في شكل بيليه بعد إزالة الماء. وهذا أمر ذو أهمية خاصة بالنسبة للبكتيريا السلبية الغرام، التي تحتوي على جدار الخلية أرق لأنها أكثر عرضة للتمزق.
لضمان بيانات AFM-IR المناسبة وعالية الجودة، هناك جوانب عديدة في بروتوكول جمع البيانات ذات أهمية حاسمة. أولا، إن التجميع الصحيح للخلفية ضروري لاكتساب البيانات. وعلى وجه الخصوص، من الضروري الحفاظ على مستويات الرطوبة المستقرة في جميع أنحاء جمع الخلفية وكذلك بين الخلفية وجمع العينات. لضمان ذلك، نوصي بتطهير الجهاز بالنيتروجين والحفاظ على مستويات الرطوبة التي لا تزيد عن 25٪. يمكن أن يفرض عدم التطهير قيدا كبيرا ، خاصة في الأماكن ذات الرطوبة العالية. ثانيا، ينبغي تسليط الضوء على أهمية التحسين السليم للبقع الأشعة تحت الحمراء. للحصول على أفضل النتائج، يمكن أن تكون المعرفة المسبقة حول موقف الفرقة ماكسيما مفيدة. على سبيل المثال، يمكن استخدام طيف الأشعة تحت الحمراء التقليدي من الكريات البكتيرية لتحديد مواقع النطاقات المتوقعة من العينة. إذا لم يكن ذلك ممكنا للحصول على ، كنهج بديل ، يمكن للمستخدم الاستفادة من أطياف الأشعة تحت الحمراء المتاحة في الأدب أو البدء في التحسين باستخدام موقف الفرقة التي من المعقول أن نتوقع في البكتيريا (على سبيل المثال ، amide الأول وAamie الثاني). ثالثا، بالنسبة لجمع البيانات، من المهم تسليط الضوء على أهمية اختيار الطاقة بعناية (مما يسمح بتحقيق نسبة S/N جيدة)، لأنه يمكن أن يكون له تأثير مدمر. تعتمد الطاقة الموصى بها على سمك العينة ، مع توفر إرشادات تقريبية في دليل الأداة31. نوصي باختبار حالة العينة بعد القياس تجريبيا من خلال جمع صورة AFM ، لأنها ستكشف عن أي تأثير مدمر. وعلاوة على ذلك، فإن جمع صور AFM من نفس المنطقة قبل وبعد جمع أطياف AFM-IR بمثابة تأكيد جيد على أنه لم يحدث أي انجراف وأن الأطياف تنشأ بالفعل من النقطة المختارة في الخلية. إن إمكانية الانجراف مهمة بشكل خاص عند تطبيق طريقة التصوير ، من خلال التصوير المتتالي لكثافة الأشعة تحت الحمراء في قيم محددة. مثال على ذلك موضح في الشكل 5. تم تعريف المنطقة المصورة في بداية التجربة والمقصود بها أن تكون متسقة مع جميع قيم عدد الموجات. ومع ذلك، يظهر انجراف واضح بين كل صورة ارتفاع AFM (وكثافة عدد الموجات الأشعة تحت الحمراء المقابلة)، مع وقت اقتناء كل خريطة من حوالي 40 دقيقة. ونتيجة لذلك ، بالنسبة للمستخدمين الذين يجمعون بيانات التصوير ، نوصي دائما بتحديد منطقة أكبر قليلا من عينة الاهتمام ، لضمان أنه حتى عند وجود الانجراف ، ستبقى عينة الاهتمام داخل المنطقة المصورة.
وتشمل القيود المحتملة للبروتوكول عدم القدرة على جمع البيانات في حالة رطبة في الحلول الفسيولوجية (مثل المالحة أو برنامج تلفزيوني) المذكورة أعلاه. وعلاوة على ذلك، وخاصة في المناطق ذات الرطوبة العالية، غالبا ما تكون هناك حاجة لتطهير النيتروجين. وعلاوة على ذلك، يمكن البروتوكول من استكشاف الكائنات الحية إلى 100 نانومتر في الحجم، باستثناء إمكانية استخدامه للهياكل الأصغر حجما. على الرغم من أنه يمكن التغلب على ذلك باستخدام ليزر مختلف (على سبيل المثال ، ليزر سلسلة الكم مما يسمح بتحقيق الدقة المكانية من 20 نانومتر) ، ويرتبط أيضا مع نطاق طيفي محدود وكذلك صعوبات في الحصول على إشارة جيدة إلى نسبة الضوضاء. وأخيرا، قد يمثل فحص الأسطح الناعمة تحديا مع عدم اكتشاف الطرف للسطح بشكل صحيح وتجاوز نقطة الاتصال، حتى الكسر. على الرغم من أن هذا عادة لا مشكلة مع عينات بكتيرية، فإنه قد يحدث عند قياسات عينات ليونة. في مثل هذه الحالات ، يوصى بمحاولة الانخراط على سطح نظيف من الركيزة بالقرب من العينة.
ويمكن استخدام البروتوكول الموصوف لأنواع عديدة من البحوث البكتيرية، بما في ذلك الدراسات المقارنة بين عينات مختلفة وكذلك الفحص دون الخلوي. يمكن تحليل البيانات باستخدام نهج القياس الكيميائي لأطياف واحدة وطرائق التصوير35، اعتمادا على هدف البحث. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تعديل البروتوكول لتطبيقه على المواد البيولوجية الأخرى (مثل الفطريات والخميرة والخلايا، وما إلى ذلك)، من خلال إضافة التثبيت.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نعترف ببروكر لدعمه. وقد دعم هذا العمل منحة نجاح المرأة من جامعة موناش .” تعترف A.Y.P بالدعم المقدم من زمالة ممارسي المجلس الوطني الأسترالي للصحة والبحوث الطبية (APP1117940). تم تمويل هذا العمل من قبل مشروع اكتشاف مجلس البحوث الأسترالي DP180103484. ونود أن نشكر السيد فينلي شانكز على دعمه الفعال والسيدة زينيا كوستولياس على مساعدتها التقنية في العينات.
Materials
| AFM metal specimen disc | PST ProSciTech Pty Ltd | GA530-15 | Recommended 15 mm |
| Anasys AFM-IR nanoIR2 | Anaysys Instruments | 0 | model: nanoIR2 |
| Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2 | Bruker / Anasys Instruments | – | Model: Model: PR-EX-NIR2 |
| Heraeus Pico 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | – | – |
| Matlab | Mathworks Inc | – | Multivariate data analysis software |
| Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL | Heathrow Scientific | HEA4323 | Can be replaced with any other micro-centrifuge tube |
| NanoIR 2 instrument | Bruker / Anasys Instruments | – | – |
| PLS toolbox | Mathworks Inc | – | GUI for Matlab |
| Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates) | Thermo Fisher | PP2001 | Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment |
| Selected bacterial strain | – | – | The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.) |
| Substrate (e.g. Raman grade CaF2) | Crystran | CAFP13-2R | Recommended size: 13 mm Ø x 2.0 mm |
| Tip pipette 1000 µl | Axygen | T-1000-B | – |
| Tip pipette 200 µl | Axygen | T-200-C | – |
| Tip pipette 0.5-10 µl | Axygen | T-300-R | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
References
- Sears, C. L. A dynamic partnership: celebrating our gut flora. Anaerobe. 11 (5), 247-251 (2005).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Seymour, C. W., et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. The New England Journal of Medicine. 376 (23), 2235-2244 (2017).
- Weiss, S. L., et al. Delayed antimicrobial therapy increases mortality and organ dysfunction duration in pediatric sepsis. Critical Care Medicine. 42 (11), 2409-2417 (2014).
- Peker, N., Couto, N., Sinha, B., Rossen, J. W. Diagnosis of bloodstream infections from positive blood cultures and directly from blood samples: recent developments in molecular approaches. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 24 (9), 944-955 (2018).
- Aminov, R. I. The role of antibiotics and antibiotic resistance in nature. Environmental Microbiology. 11 (12), 2970-2988 (2009).
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nature Medicine. 10 (12), 122-129 (2004).
- Roca, I., et al. The global threat of antimicrobial resistance: science for intervention. New Microbes and New Infections. 6, 22-29 (2015).
- O’Neill, J. The review on antimicrobial resistance. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. Wellcome Trust. , (2016).
- Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what’s new. Current Opinion in Microbiology. 21, 45-50 (2014).
- Piddock, L. J. Assess drug-resistance phenotypes, not just genotypes. Nature Microbiology. 1 (8), 16120 (2016).
- Naumann, D., Helm, D., Labischinski, H. Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy. Nature. 351 (6321), 81-82 (1991).
- Zarnowiec, P., Lechowicz, L., Czerwonka, G., Kaca, W. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) as a tool for the identification and differentiation of pathogenic bacteria. Current Medicinal Chemistry. 22 (14), 1710-1718 (2015).
- Quintelas, C., Ferreira, E. C., Lopes, J. A., Sousa, C. An overview of the evolution of infrared spectroscopy applied to bacterial typing. Biotechnology Journal. 13 (1), 1700449 (2018).
- San-Blas, E., Cubillán, N., Guerra, M., Portillo, E., Esteves, I. Characterization of xenorhabdus and photorhabdus bacteria by Fourier transform mid-infrared spectroscopy with attenuated total reflection (FT-IR/ATR). Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 93, 58-62 (2012).
- Sousa, C., et al. Discrimination of the acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex species by Fourier transform infrared spectroscopy. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 33 (8), 1345-1353 (2014).
- Rodriguez-Saona, L. E., Khambaty, F. M., Fry, F. S., Calvey, E. M. Rapid detection and identification of bacterial strains by Fourier transform near-infrared spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49 (2), 574-579 (2001).
- Dawson, S. E., et al. Implementation of Fourier transform infrared spectroscopy for the rapid typing of uropathogenic Escherichia coli. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 33 (6), 983-988 (2014).
- Kochan, K., et al. Detection of Antimicrobial Resistance-Related Changes in Biochemical Composition of Staphylococcus aureus by Means of Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15397-15403 (2019).
- Dazzi, A., Prater, C. B. AFM-IR: Technology and Applications in Nanoscale Infrared Spectroscopy and Chemical Imaging. Chemical Reviews. 117 (7), 5146-5173 (2017).
- Dazzi, A., et al. AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization. Applied Spectroscopy. 66 (12), 1365-1384 (2012).
- Kochan, K., et al. et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria. Journal of the Royal Society, Interface. 15 (140), (2018).
- Katzenmeyer, A. M., et al. Mid-infrared spectroscopy beyond the diffraction limit via direct measurement of the photothermal effect. Nanoscale. 7 (42), 17637-17641 (2015).
- . Bruker Life Science Applications Available from: https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html (2020)
- Mayet, C., Dazzi, A., Prazeres, R., Ortega, J. M., Jaillard, D. In situ identification and imaging of bacterial polymer nanogranules by infrared nanospectroscopy. Analyst. 135 (10), 2540-2545 (2010).
- Baldassarre, L., et al. Mapping the amide I absorption in single bacteria and mammalian cells with resonant infrared nanospectroscopy. Nanotechnology. 27 (7), 075101 (2016).
- Vitry, P., et al. Combining infrared and mode synthesizing atomic force microscopy: Application to the study of lipid vesicles inside Streptomyces bacteria. Nano Research. 9 (6), 1674-1681 (2016).
- Dazzi, A., et al. Chemical mapping of the distribution of viruses into infected bacteria with a photothermal method. Ultramicroscopy. 108 (7), 635-641 (2008).
- Steenbergen, J. N., Alder, J., Thorne, G. M., Tally, F. P. Daptomycin: a lipopeptide antibiotic for the treatment of serious Gram-positive infections. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 283-288 (2005).
- Garcia, L. S. MacFarlan Standards. Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd Edition. , (2010).
- NanolR-2 System Manual. Anasys Instruments Available from: https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf (2020)
- Whelan, D. R., et al. Detection of an en masse and reversible B- to A-DNA conformational transition in prokaryotes in response to desiccation. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (97), 20140454 (2014).
- McGuinness, W. A., Malachowa, N., DeLeo, F. R. Vancomycin Resistance in Staphylococcus aureus. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (2), 269-281 (2017).
- Howden, B. P., Peleg, A. Y., Stinear, T. P. The evolution of vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heterogenous-VISA. Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 21, 575-582 (2014).
- Perez-Guaita, D., et al. Multispectral Atomic Force Microscopy-Infrared Nano-Imaging of Malaria Infected Red Blood Cells. Analytical Chemistry. 90 (5), 3140-3148 (2018).
