Astyanax mexicanus'ta Maksimal Üreme ve Yumurtlama için Artımlı Sıcaklık Değişiklikleri
Summary
Bu makale, gelişimsel ve evrimsel çalışmalar için ortaya çıkan bir model olan Meksika tetra Astyanax mexicanus’tamaksimum yumurtlamayı teşvik etmek için artımlı bir sıcaklık rejimi için temel laboratuvar koşullarını ve protokollerini özetlemektedir.
Abstract
Meksika tetrası, Astyanax mexicanus, gelişim ve evrim çalışmaları için gelişmekte olan bir model sistemidir. Bu türdeki göz yüzeyi (yüzey balıkları) ve kör mağara (mağara balıkları) morflarının varlığı, morfolojik ve davranışsal evrimin altında kalan mekanizmaları sorgulamak için bir fırsat sunun. Mağara balıkları yeni yapıcı ve gerici özellikler geliştirmişler. Yapıcı değişiklikler arasında tat tomurcukları ve çenelerdeki artışlar, yanal çizgi duyu organları ve vücut yağları bulunur. Gerileyen değişiklikler arasında gözlerin kaybı veya azalması yer almaktadır. melanin pigmentasyonu, okul davranışı, saldırganlık ve uyku. Bu değişiklikleri deneysel olarak sorgulamak için, çok sayıda yumurtlanmış embriyo elde etmek çok önemlidir. Orijinal A. mexicanus yüzey balıkları ve mağara balıkları 1990’larda Teksas ve Meksika’da toplandığından beri, torunları Jeffery laboratuvarında iki ayda bir çok sayıda embriyo yetiştirmeleri ve doğurmaları için rutin olarak uyarıldı. Üreme gıda bolluğu ve kalitesi, açık-karanlık döngüler ve sıcaklık tarafından kontrol edilmesine rağmen, artımlı sıcaklık değişikliklerinin maksimum yumurtlamayı teşvik etmede önemli bir rol oynadığını bulduk. Bir üreme haftasının ilk üç gününde sıcaklığın 72 ° F’den 78 ° F’ye kademeli olarak artması, maksimum sayıda yüksek kaliteli embriyo ile art arda iki-üç yumurtlama günü sağlar ve ardından yumurtlama haftasının son üç gününde sıcaklığın kademeli olarak 78 ° F’den 72 ° F’ye düşmesi takip edilir. Bu videoda gösterilen prosedürler, artımlı sıcaklık uyarılmış yumurtlama için bir laboratuvar üreme haftasından önce ve sırasında iş akışını özetler.
Introduction
Teleost Astyanax mexicanus, yüzeyde yaşayan (yüzey balığı) bir forma sahiptir ve birçok farklı kör mağarada yaşayan (mağara balığı)form 1,2. Mağara balıkları sürekli karanlıkta ve yiyecek sınırlamaları altında evrimleşmiştir, bu da yeni yapıcı ve gerileyen özelliklerin ortaya çıkmasına neden3. Yapıcı özellikler arasında tat tomurcukları ve çene büyüklüğündeki artışlar, yanal çizginin duyu organları ve yağ rezervleri bulunur. Regresif özellikler melanin pigmentasyonunun, gözlerin ve uyku, okul ve saldırganlık gibi davranışların kaybını veya azaltılmasını içerir. Astyanax sisteminin bir özelliği, yapıcı ve gerici evrim4,5,6,7ile ilişkili genomik bölgeleri belirlemek için nicel özellik loci (QTL) eşlemesinin kullanılmasına izin vererek iki form arasındaki tam doğurganlıktır. A. mexicanus, laboratuvarda sık sık yumurtlamaya indüklenebildiğinden, gelişimi incelemek için avantajlı bir sistem sunar. A. mexicanus embriyoları yarı saydamdır, zebra balıklarından biraz daha büyüktür, büyük miktarlarda üretilir ve yaklaşık 8-12 ay içinde cinsel olarak olgun yetişkinlere dönüşür. Maksimum yumurtlama kapasiteleri yaklaşık 5 yıldır. Bu protokol, tipik bir üreme haftasında bir A. mexicanus kültür tesisinde ihtiyaç duyulan iş akışını açıklar ve balık sistemi bakımı ve maksimum yumurtlama için sıcaklık kontrol rejiminin ayrıntılarını içerir.
A. mexicanus kireçtaşı platolarından (yüzey balıkları) kaynaklanan nehirlerde ve kireçtaşı mağaralarındaki havuzlarda (mağara balıkları) yaşayan tropikal bir balıktır8. Kireçtaşı sert su üretmek için çözünür ve A. mexicanus sert suda gelişir. Sert su koşullarına uyarlanmış balıklar bir dizi tuzlu durumu tolere edebilir, ancak genellikle belirli olanlarda ürer9. Yumurtlama davranışının indüksiyonu faktörlerin bir kombinasyonu ile gerçekleştirilir. Balıklar soğukkanlı olduklarından ve homeostazlarını korumak için çevrelerine güvendikleri için, metabolizmaları çevresel değişikliklere duyarlıdır ve stresörlere daha hızlı tepki verirler10. A. mexicanus, su akışı, pH, iletkenlik, ozmotik basınç, aydınlatma ve su sıcaklıklarının özenle düzenlenmiş koşulları altında su sistemlerinde kültürlenmelidir.
Jeffery laboratuvarında, balıklar iki akan su sisteminde tutulur: (1) cinsel olgunluluk öncesinde genç yetişkin balıklar için bir “bebek sistemi” ve (2) cinsel olarak olgun, üreme yetişkinleri için yetişkin (veya ana) bir sistem. “Bebek sistemi”, akan su ile birlikte verilen 8 L ve 15 L tanklardan oluşur. “Bebek sistemi”, larvalardan yetiştirilen yavru ve genç metamorfozize yavrular tarafından daha küçük (1-10 L) tanklarda tohumlanır ve bu tanklarda haftalık olarak su alışverişi yapılır. Larvalar, yavrular ve gençler son derece gıdaya bağımlıdır ve yüksek oranda hayatta kalma sağlamak için günde bir kez canlı yiyeceklerle (salamura karides) beslenmelidir. “Bebek sisteminden” genç gençler yaklaşık 1-1,5 yıl sonra yetişkin sistemine yerleştirilir. İlk başta, toz haline getirilmiş tetra pulları ile beslenirler ve daha fazla büyümeden sonra normal yetişkin beslenme rejimine aktarılırlar. Cinsel olgunluk kadınlarda karın hacmi ile değerlendirilebilir ve cinsiyet belirleme yöntemleritanımlanmıştır 11. Yetişkin sisteminde, su 24 saatlik periyotta 3 kez 42 L tankta otomatik olarak değiştirilir. Yetişkin sistemi her gün görsel muayene ve problardan gelen otomatik sıcaklık, pH ve iletkenlik okumaları ile izlenir. Optimum pH yaklaşık 7,4’tür ve 6,8-7,5 arasında değişebilir, sistemin taban sıcaklığı 72/73 °F ve ideal iletkenlik 600-800 mS arasında değişir. Su kalitesi üzerinde bağımsız kontroller, renk ölçümü testi kullanılarak pH, amonyak ve nitrat için sıcaklık ve ölçüm suyu kalite parametrelerinin ölçülmesi ile haftalık olarak yapılır. Amonyak ve nitrat seviyeleri, sisteme yararlı bakteriler (örneğin Nutafin Döngüsü) eklenerek sıfıra yakın veya sıfıra yakın tutulur. Oda aydınlatması, 14 saatlik ışığa ve 10 saatlik karanlık periyotlara göre ayarlanmış bir zamanlayıcı ile kontrol edilir. Yukarıda belirtilen genel su kalitesi parametrelerine ek olarak, aşağıdaki hususların bir üreme haftasında özel dikkat edilmesi gerekir.
Balıklar (laboratuvardaki mağara balıkları bile) sirkadiyen saatlerini ayarlamak için ışık döngülerine bağlı olduğundan, ilk dikkat edilmesi gereken fotoperiyoddur. Sirkadiyen ritimler üreme ve beslenmeden bağışıklık sistemi sağlığına kadar her şeyi etkileyebilir12,13 ve maksimum sağlık yararları için tutarlı olmalıdır. Balıklar 14 saatlik ışık ve 10 saatlik karanlık fotoperiyod üzerinde akan su sisteminde tutulur. Yüzey balıkları genellikle sistem karardıktan bir saat sonra yumurtlamaya başlar ve bu süre zarfında tanıtılan ışık yumurtlamaya müdahale edebilir ve sonlandırabilir. Kör mağara balıklarının yumurtlaması ışıktan daha az rahatsızdır. Yüzey balıklarının yumurtlamasıyla karşılaştırıldığında, mağara balıklarının yumurtlaması gecikir, genellikle sistem karardıktan dört ila beş saat sonra başlar.
İkinci husus beslenmedir. Yetişkin balıklar normalde günde bir kez tetra gevreği diyeti ile beslenir. Yumurtlamadan önce, balıklar ekstra miktarlarda tetra gevreği ve diğer yiyeceklerle desteklenmiş protein bakımından zengin bir diyetle beslenir: yumurta sarısı gevreği ve bazen yaşayan Kaliforniya kara kurtları (Lumbriculus variegatus) önceki yumurtlama döngüsü sırasında yumurta üretimi nedeniyle protein kaybını telafi etmek için. Üreme haftasında, balıklar günde iki kez, sabah bir kez ve öğleden sonra / akşam tekrar beslenir. Günde sadece bir kez beslenen balıklar, ancak yiyeceklerin çok büyük bir kısmı ile kaçınılmalıdır, çünkü bu yetersiz beslenmeye neden olabilir14.
Üçüncü husus uzaydır. Alan gereksinimleri, bir yetişkinin ortalama vücut kütlesinin yanı sıra balıkların okul davranışına veya agresif davranışlara sahip olup olmadığı gibi davranışsal hususlara dayanmaktadır. Aşırı veya az kalabalık tanklar, artan saldırganlık ve sürekli strese yol açabilir, balıkları tank arkadaşlarının yaralanmasına karşı savunmasız hale getirir ve yumurtlamaya katılmak için isteksiz15. Genellikle 42 L tank başına 10-20 balık barındırıyoruz.
Dördüncü husus sıcaklıktır. Yukarıda belirtildiği gibi, balıklar soğukkanlı hayvanlardır ve vücut sıcaklığını korumak için çevreye güvenirler. Sıcaklığın metabolik süreçler üzerinde doğrudan bir etkisi olduğundan, sıcaklıktaki değişiklikler balıklarda davranış değişikliklerini tetikleyebilir16. Bu üreme programı sıcaklıkta iki haftalık döngülerden oluşur: ilk hafta 78 ° F’ye bir sıcaklık artışı sağlar ve ertesi hafta 72 ° F statik sıcaklığı korur. İlk (üreme) hafta boyunca, her akşam tankların dibine plastik kenarlı üreme ağları yerleştirilir. Üreme ağları, tanklardaki balıklar ile yumurtlanan yumurtalar arasında bir bariyer görevi görer, aksi takdirde tüketilir. Sıcaklık hafta ortasına kadar günde 2 ° F ile maksimum 78 ° F’ye yükseltilir ve yumurtlama bu haftanın ilk 2-3 akşamındaki ışık döngüsüne göre indüklendi. Sıcaklık daha sonra haftanın kalan günlerinde 2 ° F artışla 72 ° F’ye düşürülür ve baz sıcaklık bir sonraki üreme haftasının başına kadar korunur. Üreme genellikle balık zamanının iyileşmesine izin vermek için ayda en fazla iki kez uyarılır.
Genel olarak, bu yöntem daha uzun bir süre boyunca en yüksek kaliteli embriyoların büyük miktarlarda yumurtlasını sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Astyanax mexicanus, sık sık yumurtlayan ve laboratuvarda kolayca yetiştirilebilen yeni bir biyolojik modeldir1,2. A. mexicanus mağara balıklarındaki evrimsel değişimlerin altında yatan gelişimsel mekanizmalarla ilgilendiğimiz için embriyo üretimi ve kullanımı araştırma hedeflerimiz için hayati önem taşımaktadır. Yetişkin bir balık stoğunun korunmasının birincil amacı, gelişim deneylerinde kullanılmak ve yetişkin ü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jeffery laboratuvarı A. mexicanus kültür tesisine değerli katkılarından dolayı David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote ve Mandy Ng’ye teşekkür ederiz. Jeffery laboratuvarındaki araştırma şu anda NIH hibe EY024941 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
- Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).
- Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
- Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
- O’Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
- Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
- Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
- Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
- Borowsky, R. . Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , (2008).
- Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
- Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
- Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
- Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
- Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
- Borowsky, R. . In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , (2008).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
- Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
- Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
- Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
- Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).
