Summary

Постепенные изменения температуры для максимального размножения и нереста у Astyanax mexicanus

Published: February 14, 2021
doi:

Summary

В данной статье изложены основные лабораторные условия и протоколы для инкрементального температурного режима для стимуляции максимального нереста у мексиканской тетра Astyanax mexicanus,которая является формирующейся моделью для исследований развития и эволюции.

Abstract

Мексиканская тетра, Astyanax mexicanus,является формирующейся модельной системой для исследований в области развития и эволюции. Существование глазных поверхностных (поверхностных рыб) и слепых пещерных (пещерных рыб) морфов у этого вида дает возможность исследовать механизмы, лежащие в основе морфологической и поведенческой эволюции. Пещерные рыбы развили новые конструктивные и регрессивные черты. Конструктивные изменения включают увеличение вкусовых рецепторов и челюстей, органов чувств боковой линии и жира в организме. Регрессивные изменения включают потерю или уменьшение глаз. пигментация меланина, школьное поведение, агрессия и сон. Чтобы экспериментально исследовать эти изменения, крайне важно получить большое количество порожденных эмбрионов. С тех пор, как оригинальные поверхностные рыбы A. mexicanus и пещерные рыбы были собраны в Техасе и Мексике в 1990-х годах, их потомков регулярно стимулировали к размножению и нересту большого количества эмбрионов два раза в год в лаборатории Джеффри. Хотя размножение контролируется изобилием и качеством пищи, светло-темными циклами и температурой, мы обнаружили, что постепенные изменения температуры играют ключевую роль в стимулировании максимального нереста. Постепенное повышение температуры с 72 ° F до 78 ° F в первые три дня недели размножения обеспечивает два-три последовательных нерестовых дня с максимальным количеством высококачественных эмбрионов, за которым следует постепенное снижение температуры с 78 ° F до 72 ° F в течение последних трех дней нерестовой недели. Процедуры, показанные в этом видео, описывают рабочий процесс до и во время недели лабораторной селекции для стимуляции нереста с добавочной температурой.

Introduction

Телеост Astyanax mexicanus имеет глазкую поверхностно-обитую (поверхностную рыбу) форму и множество различных слепых пещерных (пещерных рыб) форм1,2. Пещерные рыбы эволюционировали в вечной темноте и под ограничениями пищи, что привело к появлению новых конструктивных и регрессивных черт3. Конструктивные черты включают увеличение вкусовых рецепторов и размера челюсти, органов чувств боковой линии и жировых запасов. Регрессивные черты включают потерю или уменьшение пигментации меланина, глаз и поведения, таких как сон, школьное образование и агрессия. Атрибутом системы Astyanax является полная фертильность между двумя формами, позволяющая использовать количественное отображение локусов признаков (QTL) для определения геномной области (областей), связанной с конструктивной и регрессивной эволюцией4,5,6,7. A. mexicanus предлагает выгодную систему для изучения развития, потому что его можно заставить часто нереститься в лаборатории. Эмбрионы A. mexicanus полупрозрачные, немного крупнее, чем у рыбок данио, производятся в больших количествах и развиваются в половозрелых взрослых особей примерно через 8-12 месяцев. Их период максимальной нерестоспособности составляет около 5 лет. Этот протокол описывает рабочий процесс, необходимый на объекте культивирования A. mexicanus в течение типичной недели размножения, и включает в себя детали обслуживания рыбной системы и режима контроля температуры для максимального нереста.

A. mexicanus – тропическая рыба, которая живет в реках, берущих начало на известняковых плато (поверхностные рыбы) и в бассейнах в известняковых пещерах (пещерные рыбы)8. Известняк растворяется, производя жесткую воду, и A. mexicanus процветает в жесткой воде. Рыбы, адаптированные к условиям жесткой воды, могут переносить целый ряд соленых условий, но обычно размножаются в конкретных9. Индукция нерестового поведения осуществляется сочетанием факторов. Поскольку рыбы хладнокровны и полагаются на окружающую среду для поддержания гомеостаза, их метаболизм чувствителен к изменениям окружающей среды, и они быстрее реагируют на стрессоры10. A. mexicanus следует культивируем в водных системах в тщательно регулируемых условиях потока воды, рН, проводимости, осмотического давления, освещения и температуры воды.

В лаборатории Джеффри рыбы поддерживаются в двух системах проточной воды: (1) «детская система» для молодых взрослых рыб до половой зрелости и (2) взрослая (или основная) система для половозрелых, размножающихся взрослых особей. «Детская система» состоит из резервуаров на 8 л и 15 л, снабженных проточной водой. «Детская система» засеивается мальками и молодыми метаморфизованными молодыми особями, выращенными из личинок в меньших (1-10 л) резервуарах, в которых еженедельно обменивается водой. Личинки, мальки и молодь чрезвычайно зависят от пищи и должны питаться живым кормом (солеными креветками) один раз в день, чтобы обеспечить высокий уровень выживаемости. Молодых особей из «детской системы» помещают во взрослую систему примерно через 1-1,5 года. Сначала их кормят измельченными тетрахлопьями, а после дальнейшего роста переводят в обычный режим кормления взрослых особей. Половую зрелость можно оценить по объему живота у самок, а методы определения пола были описаны11. Во взрослой системе вода автоматически обменивается в резервуарах по 42 л 3 раза за 24-часовой период. Система для взрослых ежедневно контролируется визуальным осмотром и автоматическими показаниями температуры, рН и проводимости с помощью датчиков. Оптимальный pH составляет около 7,4 и может варьироваться между 6,8-7,5, базовая температура системы составляет 72/73 ° F, а идеальная проводимость колеблется между 600-800 мС. Автоматические показания отображаются на экране контроллера, а визуальные проверки давления воды считываются на расходомерах, распределенных по всей системе. Независимые проверки качества воды проводятся еженедельно путем тестирования температуры и измерения параметров качества воды для pH, аммиака и нитрата с использованием колориметрического теста. Уровни аммиака и нитратов удерживаются на уровне или близко к нулю путем добавления полезных бактерий (например, цикла нутафинов) в систему. Освещение помещения управляется таймером, настроенным на 14-часовой световой и 10-часовой темные периоды. В дополнение к общим параметрам качества воды, упомянутым выше, следующие соображения требуют особого внимания в течение недели размножения.

Первым соображением является фотопериод, так как рыбы (даже пещерные рыбы в лаборатории) зависят от световых циклов, чтобы установить свои циркадные часы. Циркадные ритмы могут влиять на все, от размножения и кормления до здоровья иммунной системы12,13 и должны быть последовательными для максимальной пользы для здоровья. Рыбы поддерживаются в системе проточной воды на 14-часовом свете и 10-часовом темном фотопериоде. Поверхностные рыбы обычно начинают нерест через час после того, как система потемнела, и свет, введенный в этот период, может мешать и прекращать нерест. Нерест слепых пещерных рыб меньше нарушается светом. По сравнению с нерестом поверхностных рыб, нерест пещерной рыбы задерживается, обычно начиная через четыре-пять часов после того, как система потемнела.

Второе соображение – это питание. Взрослых рыб обычно кормят рационом из тетрахлопьев один раз в день. Перед нерестом рыбу кормят богатой белком диетой, дополненной дополнительным количеством тетрахлопьев и другой пищи: яичными желтковыми хлопьями и иногда живыми калифорнийскими черными червями(Lumbriculus variegatus),чтобы компенсировать потерю белка из-за производства яиц во время предыдущего нерестового цикла. В течение недели размножения рыб кормят два раза в день, один раз утром и снова днем / вечером. Рыб, кормящихся только один раз в день, но с одной очень большой порцией пищи, следует избегать, так как это может вызвать недоедание14.

Третье соображение – это пространство. Требования к пространству основаны на средней массе тела взрослой особи, а также на поведенческих соображениях, таких как наличие у рыб стайного поведения или агрессивного поведения. Переполненные или недонаселенные аквариумы могут привести к повышенной агрессии и постоянному стрессу, что делает рыб уязвимыми к травмам от своих товарищей по аквариуму и неохотно участвует в нересте15. Обычно мы размещаем 10-20 рыб на 42 л аквариума.

Четвертое соображение – это температура. Как упоминалось выше, рыбы являются хладнокровными животными и полагаются на окружающую среду для поддержания температуры тела. Поскольку температура оказывает непосредственное влияние на метаболические процессы, изменения температуры могут вызвать поведенческие изменения у рыб16. Эта программа разведения состоит из двухнедельных циклов температуры: первая неделя вводит скачок температуры до 78 ° F, а следующая неделя поддерживает статическую температуру 72 ° F. В течение первой (племенной) недели на дно резервуаров каждый вечер помещаются гнездовые сети с пластиковыми краями. Гнездовые сети служат барьером между рыбой в аквариумах и нерестяными яйцами, которые в противном случае были бы съедены. Температура повышается на 2 ° F в день до максимума 78 ° F к середине недели, и нерест индуцируется в соответствии с световым циклом в первые 2-3 вечера этой недели. Затем температура понижается на 2 ° F с шагом до 72 ° F в течение оставшихся дней недели, а базовая температура поддерживается до начала следующей недели размножения. Размножение обычно стимулируется не чаще двух раз в месяц, чтобы дать рыбе время на восстановление.

В целом, этот метод позволяет нерестить большое количество эмбрионов самого высокого качества в течение более длительного периода времени.

Protocol

Эта процедура была одобрена руководящими принципами институционального ухода за животными Университета Мэриленда, Колледж-Парк (в настоящее время IACUC 469 #R-NOV-18-59; Проект 1241065-1). Рисунок 1. Календари в течен?…

Representative Results

Как правило, мы разводим и нерестим потомков поверхностных рыб, первоначально собранных в Насимиенто-дель-Рио-Чой в Сан-Луис-Потоси, Мексика (поверхностная рыба Рио-Чой) и Сан-Соломон-Спрингс в государственном парке Балморхеа, штат Техас (техасская поверхностная рыба), и пещерных рыб, по?…

Discussion

Astyanax mexicanus – это новая биологическая модель, которая часто нерестится и может быть легко выведена в лаборатории1,2. Поскольку мы заинтересованы в механизмах развития, лежащих в основе эволюционных изменений в пещерных рыбах A. mexicanus, производство ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Дэвида Мартасяна, Дидре Хейзера, Эми Паркхерст, Крейга Фута и Мэнди Нг за ценный вклад в культурный центр лаборатории Джеффри A. mexicanus. Исследования в лаборатории Джеффри в настоящее время поддерживаются грантом NIH EY024941.

Materials

Blackworms Eastern Aquatics, Lancaster, PA None
Breeding Nets Custom made
Brine shrimp eggs AquaCave Lake Forest, IL. None
Colorimetric test kit Petco SKU:11916 API Freshwater pH Test Kit
Egg yolk flakes Pentair, Minneapolis, MN None
Fingerbowls Carolina Biological Supply 741004 Culture dishes, 4.5 in, 250 mL
Hand held nets Any Pet Store
Incubator for embryos Fisher Scientific 51-029-321HPM 405 L
Instant Ocean sea salts Spectrum Brands, Blacksburg, VA None
Methylene Blue Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M9140
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 13-678-20 5.75 in.
Net soaking solution Any Pet Store
Nutrafin Cycle Amazon None Bacterial boost
Refrigerator for live feed Any source
Stereomicroscope Any source
Thermometer Any source
Tetra Tropical Crisps Spectrum Brands, Blacksburg, VA None

References

  1. Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).
  2. Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
  3. Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
  4. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
  5. Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
  6. O’Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
  7. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
  8. Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
  9. Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
  10. Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
  11. Borowsky, R. . Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , (2008).
  12. Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
  13. Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
  14. Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
  15. Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
  16. Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
  17. Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
  18. Borowsky, R. . In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , (2008).
  19. Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
  20. Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
  21. Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
  22. Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
  23. Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
  24. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
  25. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).

Play Video

Cite This Article
Ma, L., Dessiatoun, R., Shi, J., Jeffery, W. R. Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus. J. Vis. Exp. (168), e61708, doi:10.3791/61708 (2021).

View Video