Mudanças de temperatura incremental para reprodução e desova máxima em Astyanax mexicanus
Summary
Este artigo descreve as condições básicas de laboratório e protocolos para um regime de temperatura incremental para estimular a desova máxima no tetra mexicano Astyanax mexicanus, que é um modelo emergente para estudos de desenvolvimento e evolutivos.
Abstract
O tetra mexicano, Astyanax mexicanus,é um sistema modelo emergente para estudos em desenvolvimento e evolução. A existência de morfas de superfície de olhos (peixes superficiais) e cavernas cegas (peixes-caverna) nesta espécie apresenta uma oportunidade para interrogar os mecanismos subjacentes à evolução morfológica e comportamental. Os peixes das cavernas desenvolveram novos traços construtivos e regressivos. As mudanças construtivas incluem aumentos nas papilas gustativas e mandíbulas, órgãos sensoriais de linha lateral e gordura corporal. As mudanças regressivas incluem perda ou redução de olhos. pigmentação de melanina, comportamento de escolaridade, agressão e sono. Para interrogar experimentalmente essas mudanças, é crucial obter um grande número de embriões gerados. Desde que os peixes originais da superfície de A. mexicanus e peixes das cavernas foram coletados no Texas e no México na década de 1990, seus descendentes têm sido rotineiramente estimulados a procriar e desovar um grande número de embriões bimestriamente no laboratório Jeffery. Embora a reprodução seja controlada pela abundância e qualidade dos alimentos, ciclos claro-escuros e temperatura, descobrimos que as mudanças de temperatura incrementais desempenham um papel fundamental no estímulo à desova máxima. O aumento gradual da temperatura de 72 °F para 78 °F nos primeiros três dias de uma semana de reprodução fornece dois ou três dias consecutivos de desova com números máximos de embriões de alta qualidade, que é seguido por uma diminuição gradual da temperatura de 78 °F para 72 °F durante os últimos três dias da semana de desova. Os procedimentos mostrados neste vídeo descrevem o fluxo de trabalho antes e durante uma semana de reprodução laboratorial para desova estimulada pela temperatura incremental.
Introduction
O teleost Astyanax mexicanus tem uma forma de habitação superficial (peixes superficiais) e muitas diferentes cavernas cegas (peixes das cavernas)formam 1,2. Os peixes das cavernas evoluíram na escuridão perpétua e sob limitações alimentares, resultando no aparecimento de novos traços construtivos e regressivos3. Os traços construtivos incluem aumentos no gosto e tamanho da mandíbula, órgãos sensoriais da linha lateral e reservas de gordura. Os traços regressivos incluem a perda ou redução da pigmentação de melanina, olhos e comportamentos, como sono, escolaridade e agressão. Um atributo do sistema Astyanax é a fertilidade completa entre as duas formas, permitindo o uso de mapeamento de traço quantitativo loci (QTL) para determinar a região genômica(s) associada à evolução construtiva e regressiva4,5,6,7. A. mexicanus oferece um sistema vantajoso para estudar o desenvolvimento porque pode ser induzido a desovar com frequência em laboratório. Os embriões de A. mexicanus são translúcidos, ligeiramente maiores que os de zebrafish, produzidos em grandes quantidades, e se desenvolvem em adultos sexualmente maduros em aproximadamente 8-12 meses. Seu período de capacidade máxima de desova é de cerca de 5 anos. Este protocolo descreve o fluxo de trabalho necessário em uma instalação de cultura A. mexicanus durante uma semana típica de reprodução e inclui os detalhes da manutenção do sistema de peixes e o regime de controle de temperatura para desova máxima.
A. mexicanus é um peixe tropical que vive em rios originários de calcários (peixes superficiais) e em piscinas em cavernas de calcário (peixes-caverna)8. O calcário dissolve-se para produzir água dura, e A. mexicanus prospera em água dura. Peixes adaptados a condições de água dura podem tolerar uma série de condições salgadas, mas geralmente se reproduzem em específicas9. A indução do comportamento de desova é realizada por uma combinação de fatores. Como os peixes são a sangue frio e dependem de seu ambiente para manter a homeostase, seu metabolismo é sensível às mudanças ambientais e eles reagem mais rapidamente aos estressores10. A. mexicanus deve ser cultivado em sistemas aquáticos sob condições cuidadosamente reguladas de fluxo de água, pH, condutividade, pressão osmótica, iluminação e temperaturas da água.
No laboratório Jeffery, os peixes são mantidos em dois sistemas de água corrente: (1) um “sistema de bebês” para peixes adultos jovens antes da maturidade sexual e (2) um sistema adulto (ou principal) para adultos sexualmente maduros e reprodutores. O “sistema baby” consiste em tanques de 8 L e 15 L fornecidos com água corrente. O “sistema de bebês” é semeado por jovens jovens metamorfosizados cultivados a partir de larvas em tanques menores (1-10 L), nos quais a água é trocada semanalmente. Larvas, fritas e juvenis são extremamente dependentes de alimentos e devem ser alimentadas com comida viva (camarão salgado) uma vez por dia para garantir uma alta taxa de sobrevivência. Jovens jovens do “sistema de bebês” são colocados no sistema adulto após cerca de 1-1,5 anos. Em um primeiro momento, são alimentados com flocos de tetra pulverizados, e após um crescimento adicional são transferidos para o regime regular de alimentação de adultos. A maturidade sexual pode ser avaliada pelo volume abdominal em mulheres, e os métodos para determinar o sexo foram descritos11. No sistema adulto, a água é trocada automaticamente em tanques de 42 L 3 vezes por período de 24 horas. O sistema adulto é monitorado diariamente por inspeção visual e leituras automáticas de temperatura, pH e condutividade de sondas. O pH ideal é em torno de 7,4 e pode variar entre 6,8-7,5, a temperatura base do sistema é de 72/73 °F, e a condutividade ideal varia entre 600-800 mS. Leituras automáticas são exibidas em uma tela controladora, e verificações visuais da pressão da água são lidas em medidores de fluxo distribuídos por todo o sistema. Verificações independentes sobre a qualidade da água são feitas semanalmente testando a temperatura e medindo parâmetros de qualidade da água para pH, amônia e nitrato usando um teste colorimétrico. Os níveis de amônia e nitrato são mantidos em ou perto de zero, adicionando bactérias benéficas (por exemplo, Ciclo Nutafin) ao sistema. A iluminação da sala é controlada por um temporizador ajustado a períodos de luz e 10 horas escuras de 14 horas. Além dos parâmetros gerais de qualidade da água mencionados acima, as seguintes considerações precisam de atenção especial durante uma semana de reprodução.
A primeira consideração é o fotoperóuodo, pois os peixes (até mesmo peixes-caverna em laboratório) dependem de ciclos de luz para definir seu relógio circadiano. Os ritmos circadianos podem afetar tudo, desde a reprodução e alimentação até a saúde do sistema imunológico12,13 e devem ser consistentes para o máximo de benefícios para a saúde. Os peixes são mantidos em um sistema de água corrente em um fotoperíodo escuro de 14 horas e luz. Os peixes superficiais geralmente começam a desovar uma hora após o sistema ter sido escurecido, e a luz introduzida durante este período pode interferir e terminar a desova. A desova de peixes cegos das cavernas é menos perturbada pela luz. Em comparação com a desova de peixes superficiais, a desova de peixes das cavernas é adiada, geralmente começando de quatro a cinco horas após o sistema ter sido escurecido.
A segunda consideração é a nutrição. Peixes adultos são normalmente alimentados com uma dieta de tetra flocos uma vez por dia. Antes da desova, os peixes são alimentados com uma dieta rica em proteínas complementada com quantidades extras de flocos de tetra e outros alimentos: flocos de gema de ovo e ocasionalmente vermes-pretos da Califórnia vivos(Lumbriculus variegatus) para compensar a perda de proteínas devido à produção de ovos durante o ciclo anterior de desova. Durante a semana de reprodução, os peixes são alimentados duas vezes por dia, uma pela manhã e outra à tarde/noite. A alimentação de peixes apenas uma vez por dia, mas com uma única porção muito grande de alimentos deve ser evitada, pois isso pode causar desnutrição14.
A terceira consideração é o espaço. Os requisitos do espaço baseiam-se na massa corporal média de um adulto, bem como em considerações comportamentais, como se os peixes têm comportamento de escolaridade ou comportamento agressivo. Tanques superlotados ou sub-aglomerados podem levar a uma maior agressão e estresse constante, tornando os peixes vulneráveis a ferimentos de seus companheiros de tanque e relutantes em participar na desova15. Normalmente abrigamos 10-20 peixes por tanque 42 L.
A quarta consideração é a temperatura. Como mencionado acima, os peixes são animais de sangue frio e dependem do meio ambiente para manter a temperatura corporal. Como a temperatura tem um efeito direto nos processos metabólicos, mudanças de temperatura podem desencadear alterações comportamentais em peixes16. Este programa de reprodução consiste em ciclos de duas semanas de temperatura: a primeira semana introduz um pico de temperatura para 78 °F, e a próxima semana mantém uma temperatura estática de 72 °F. Durante a primeira semana (de reprodução), redes de reprodução com bordas plásticas são colocadas no fundo dos tanques todas as noites. As redes de reprodução servem como uma barreira entre os peixes nos tanques e os ovos desovados, que de outra forma seriam consumidos. A temperatura é elevada de 2 °F por dia para uma máxima de 78 °F até o meio da semana, e a desova é induzida de acordo com o ciclo de luz nas primeiras 2-3 noites desta semana. A temperatura é então reduzida em incrementos de 2 °F para 72 °F durante os demais dias da semana, e a temperatura base é mantida até o início da próxima semana de reprodução. A reprodução geralmente é estimulada não mais do que duas vezes por mês para permitir que o peixe se recupere.
No geral, este método permite a desova de grandes quantidades de embriões da mais alta qualidade durante um período mais longo de tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Astyanax mexicanus é um novo modelo biológico que gera com frequência e pode ser criado facilmente no laboratório1,2. Como estamos interessados nos mecanismos de desenvolvimento que estão por trás de mudanças evolutivas em peixes das cavernas A. mexicanus, a produção e o uso de embriões é vital para nossos objetivos de pesquisa. O objetivo principal de manter um estoque adulto de peixes é a produção de embriões e frituras jovens p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote e Mandy Ng por contribuições valiosas para o laboratório Jeffery A. mexicanus culture facility. A pesquisa no laboratório Jeffery é atualmente apoiada pela concessão do NIH EY024941.
Materials
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
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