Variazioni incrementali di temperatura per l'allevamento massimo e la deposizione delle uova in Astyanax mexicanus

Il teleost Astyanax mexicanus ha una forma di superficie con gli occhi (pesci di superficie) e molte diverse abitazioni cieche (pesci delle caverne)^{formano 1,2}. I pesci delle caverne si sono evoluti nell’oscurità perpetua e sotto i limiti alimentari, con conseguente comparsa di nuovi tratti costruttivi e regressivi³. I tratti costruttivi includono aumenti delle papille gustative e delle dimensioni della mascella, organi sensoriali della linea laterale e riserve di grasso. I tratti regressivi includono la perdita o la riduzione della pigmentazione della melanina, degli occhi e dei comportamenti, come sonno, scolarizzazione e aggressività. Un attributo del sistema Astyanax è la completa fertilità tra le due forme, consentendo l’uso della mappatura quantitativa dei loci dei trati (QTL) per determinare le regioni genomiche associate all’evoluzione costruttiva e regressiva^4,5,6,7. A. mexicanus offre un sistema vantaggioso per studiare lo sviluppo perché può essere indotto a deporre frequentemente le uova in laboratorio. Gli embrioni di A. mexicanus sono traslucidi, leggermente più grandi di quelli di zebrafish, prodotti in grandi quantità, e si sviluppano in adulti sessualmente maturi in circa 8-12 mesi. Il loro periodo di massima capacità di deposizione delle uova è di circa 5 anni. Questo protocollo descrive il flusso di lavoro necessario in una struttura di coltura A. mexicanus durante una tipica settimana di riproduzione e include i dettagli della manutenzione del sistema ittico e il regime di controllo della temperatura per la deposizione massima delle uova.

A. mexicanus è un pesce tropicale che vive in fiumi originari di altipiani calcarei (pesci di superficie) e in piscine in grotte calcaree (pesci delle caverne)⁸. Il calcare si dissolve per produrre acqua dura e A. mexicanus prospera in acqua dura. I pesci adattati alle condizioni dell’acqua dura possono tollerare una serie di condizioni salate, ma generalmente si riproducono in^{quelli specifici 9}. L’induzione del comportamento di deposizione delle uova è ottenuta da una combinazione di fattori. Poiché i pesci sono a sangue freddo e si affidano al loro ambiente per mantenere l’omeostasi, il loro metabolismo è sensibile ai cambiamenti ambientali e reagiscono più rapidamente agli^{stressanti 10}. A. mexicanus deve essere coltivato in sistemi acquatici in condizioni attentamente regolate di flusso d’acqua, pH, conducibilità, pressione osmotica, illuminazione e temperature dell’acqua.

Nel laboratorio Jeffery, i pesci sono mantenuti in due sistemi di acqua corrente: (1) un “sistema per bambini” per giovani pesci adulti prima della maturità sessuale e (2) un sistema adulto (o principale) per adulti sessualmente maturi e riproduttori. Il “sistema baby” è costituito da serbatoi da 8 L e 15 L forniti con acqua corrente. Il “sistema bambino” viene seminato da avannotti e giovani giovani metamorfosi coltivati da larve in serbatoi più piccoli (1-10 L), in cui l’acqua viene scambiata settimanalmente. Larve, avannotti e giovani sono estremamente dipendenti dal cibo e devono essere nutriti con cibo vivo (gamberetti salati) una volta al giorno per garantire un alto tasso di sopravvivenza. I giovani giovani del “sistema bambino” vengono inseriti nel sistema degli adulti dopo circa 1-1,5 anni. All’inizio, vengono alimentati tetra flakes polverizzati e, dopo un’ulteriore crescita, vengono trasferiti al normale regime di alimentazione degli adulti. La maturità sessuale può essere valutata dal volume addominale nelle femmine e i metodi per determinare il sesso sono stati^{descritti 11}. Nel sistema per adulti, l’acqua viene scambiata automaticamente in serbatoi da 42 L 3 volte per un periodo di 24 ore. Il sistema per adulti viene monitorato quotidianamente mediante ispezione visiva e letture automatiche di temperatura, pH e conducibilità dalle sonde. Il pH ottimale è di circa 7,4 e può variare tra 6,8-7,5, la temperatura di base del sistema è di 72/73 ° F e la conduttività ideale varia tra 600-800 mS. Le letture automatiche vengono visualizzate sullo schermo di un controller e i controlli visivi della pressione dell’acqua vengono letti ai misuratori di portata distribuiti in tutto il sistema. Controlli indipendenti sulla qualità dell’acqua vengono effettuati settimanalmente testando la temperatura e misurando i parametri di qualità dell’acqua per pH, ammoniaca e nitrato utilizzando un test colorimetrico. I livelli di ammoniaca e nitrati sono mantenuti a zero o vicini allo zero aggiungendo batteri benefici (ad esempio, ciclo nutafin) al sistema. L’illuminazione della stanza è controllata da un timer regolato su una luce di 14 ore e periodi di buio di 10 ore. Oltre ai parametri generali di qualità dell’acqua sopra menzionati, le seguenti considerazioni necessitano di particolare attenzione durante una settimana di riproduzione.

La prima considerazione è il fotoperiodo, poiché i pesci (anche i pesci delle caverne in laboratorio) dipendono dai cicli di luce per impostare il loro orologio circadiano. I ritmi circadiani possono influenzare tutto, dall’allevamento e dall’alimentazione alla salute del sistema^{immunitario 12,13} e devono essere coerenti per i massimi benefici per la salute. I pesci sono mantenuti in un sistema di acqua corrente con una luce di 14 ore e un fotoperiodo scuro di 10 ore. I pesci di superficie generalmente iniziano a deporre le uova un’ora dopo che il sistema è stato oscurato e la luce introdotta durante questo periodo può interferire e terminare la deposizione delle uova. La deposizione delle uova dei pesci delle caverne ciechi è meno disturbata dalla luce. Rispetto alla deposizione delle uova dei pesci di superficie, la deposizione delle uova dei pesci delle caverne è ritardata, di solito iniziando da quattro a cinque ore dopo che il sistema è stato oscurato.

La seconda considerazione è l’alimentazione. I pesci adulti vengono normalmente nutriti con una dieta di tetra flakes una volta al giorno. Prima della deposizione delle uova, i pesci vengono nutriti con una dieta ricca di proteine integrata con quantità extra di tetra flakes e altri alimenti: fiocchi di tuorlo d’uovo e vermi neri della California occasionalmente viventi (Lumbriculus variegatus) per compensare la perdita di proteine dovuta alla produzione di uova durante il precedente ciclo di deposizione delle uova. Durante la settimana di riproduzione, i pesci vengono nutriti due volte al giorno, una volta al mattino e di nuovo al pomeriggio / sera. Il pesce che si nutre solo una volta al giorno ma con una singola porzione molto grande di cibo dovrebbe essere evitato, in quanto ciò può causare^{malnutrizione 14}.

La terza considerazione è lo spazio. I requisiti di spazio si basano sulla massa corporea media di un adulto e su considerazioni comportamentali, ad esempio se i pesci hanno un comportamento scolastico o un comportamento aggressivo. Serbatoi sopra o sotto-affollamento possono portare a un’aggressività accresciuta e a uno stress costante, rendendo i pesci vulnerabili alle lesioni dei loro compagni di serbatoio e riluttanti a partecipare alla deposizione^{delle uova 15}. In genere ospitamo 10-20 pesci per serbatoio da 42 L.

La quarta considerazione è la temperatura. Come accennato in precedenza, i pesci sono animali a sangue freddo e si affidano all’ambiente per mantenere la temperatura corporea. Poiché la temperatura ha un effetto diretto sui processi metabolici, i cambiamenti di temperatura possono innescare alterazioni comportamentali nei^{pesci 16}. Questo programma di allevamento consiste in cicli di temperatura di due settimane: la prima settimana introduce un picco di temperatura a 78 ° F e la settimana successiva mantiene una temperatura statica di 72 ° F. Durante la prima settimana (riproduttiva), le reti da riproduzione bordate di plastica vengono posizionate sul fondo dei serbatoi ogni sera. Le reti da riproduzione fungono da barriera tra il pesce nei serbatoi e le uova deponete, che altrimenti sarebbero consumate. La temperatura viene innalzata di 2 ° F al giorno a un massimo di 78 ° F entro metà settimana e la deposizione delle uova è indotta in base al ciclo della luce nelle prime 2-3 serate di questa settimana. La temperatura viene quindi abbassata di 2 ° F incrementi a 72 ° F durante i restanti giorni della settimana e la temperatura di base viene mantenuta fino all’inizio della prossima settimana riproduttiva. L’allevamento viene solitamente stimolato non più di due volte al mese per consentire al pesce di riprendersi.

Nel complesso, questo metodo consente la deposizione delle uova di grandi quantità di embrioni di altissima qualità per un periodo di tempo più lungo.