تغييرات درجة الحرارة الإضافية لتكاثر القصوى والتفريخ في أستياناكس المكسيكي
Summary
تحدد هذه المقالة الشروط المختبرية الأساسية والبروتوكولات لنظام درجة الحرارة التدريجي لتحفيز التفريخ الأقصى في رباعية Astyanax المكسيكيةالمكسيكية ، وهو نموذج ناشئ للدراسات التنموية والتطورية.
Abstract
رباعية المكسيكية, Astyanax mexicanus, هو نظام نموذج الناشئة للدراسات في التنمية والتطور. وجود سطح العينين (الأسماك السطحية) وكهف أعمى (أسماك الكهوف) يتحول في هذا النوع يمثل فرصة لاستجواب الآليات الكامنة وراء التطور المورفولوجي والسلوكي. وقد تطورت أسماك الكهوف سمات بناءة وتراجعية جديدة. وتشمل التغييرات البناءة زيادات في براعم الذوق والفكين، والأعضاء الحسية الجانبية الخط، والدهون في الجسم. وتشمل التغييرات التراجعية فقدان العينين أو تقليلها. تصبغ الميلانين، والسلوك المدرسي، والعدوان، والنوم. لاستجواب هذه التغييرات تجريبيا، من المهم الحصول على أعداد كبيرة من الأجنة التي ولدت. منذ أن تم جمع الأسماك السطحية الأصلية A. mexicanus وأسماك الكهوف في تكساس والمكسيك في التسعينيات ، تم تحفيز أحفادهم بشكل روتيني على تربية وتفريخ أعداد كبيرة من الأجنة كل شهرين في مختبر جيفري. على الرغم من أن يتم التحكم في التربية من خلال وفرة الغذاء والجودة، ودورات ضوء الظلام، ودرجة الحرارة، وجدنا أن التغيرات في درجة الحرارة الإضافية تلعب دورا رئيسيا في تحفيز التفريخ القصوى. وتوفر الزيادة التدريجية في درجة الحرارة من 72 درجة فهرنهايت إلى 78 درجة فهرنهايت في الأيام الثلاثة الأولى من أسبوع التكاثر يومين إلى ثلاثة أيام تفريخ متتالية مع أعداد قصوى من الأجنة عالية الجودة، ثم يتبع ذلك انخفاض تدريجي في درجة الحرارة من 78 درجة فهرنهايت إلى 72 درجة فهرنهايت خلال الأيام الثلاثة الأخيرة من أسبوع التفريخ. الإجراءات المبينة في هذا الفيديو تحدد سير العمل قبل وأثناء أسبوع تربية المختبر لدرجة الحرارة الإضافية حفز تفريخ.
Introduction
وteleost Astyanax mexicanus لديه العينين سطح المسكن (سطح السمك) شكل والعديد من مختلف أعمى كهف المسكن (كهف الأسماك) أشكال1،2. تطورت أسماك الكهوف في ظلام دائم وتحت قيود الغذاء ، مما أدى إلى ظهور سمات بناءة وتراجعية جديدة3. وتشمل الصفات البناءة زيادات في براعم الذوق وحجم الفك، والأعضاء الحسية للخط الجانبي، واحتياطيات الدهون. وتشمل الصفات التراجعية فقدان أو الحد من تصبغ الميلانين، والعينين، والسلوكيات، مثل النوم، والتعليم، والعدوان. سمة من سمات نظام Astyanax هي الخصوبة الكاملة بين الشكلين ، مما يسمح باستخدام رسم خرائط سمة كمية لتحديد المنطقة الجينومية المرتبطة بالتطور البناء والتراجعي4و5و6و7. A. mexicanus يقدم نظاما مفيدا لدراسة التنمية لأنه يمكن حث على تفريخ في كثير من الأحيان في المختبر. أجنة A. mexicanus شفافة ، أكبر قليلا من تلك التي من حمار وحشي ، تنتج بكميات كبيرة ، وتتطور إلى البالغين الناضجين جنسيا في حوالي 8-12 شهرا. فترة طاقة التفريخ القصوى حوالي 5 سنوات. يصف هذا البروتوكول سير العمل المطلوب في منشأة زراعة مكسيكية خلال أسبوع تربية نموذجي ويتضمن تفاصيل صيانة نظام الأسماك ونظام التحكم في درجة الحرارة للتفريخ الأقصى.
أ. المكسيكية هي سمكة استوائية تعيش في الأنهار التي تنشأ في الهضاب الجيرية (الأسماك السطحية) وفي برك في كهوف الحجر الجيري (أسماك الكهوف)8. يذوب الحجر الجيري لإنتاج المياه الصلبة، و A. mexicanus يزدهر في الماء الصلب. الأسماك تتكيف مع ظروف المياه الصلبة يمكن أن تتسامح مع مجموعة من الظروف المالحة، ولكن تولد عموما في تلك محددة9. يتم تحقيق تحريض سلوك التفريخ من خلال مجموعة من العوامل. لأن الأسماك بدم بارد وتعتمد على بيئتها للحفاظ على التوازن، والتمثيل الغذائي لها حساسة للتغيرات البيئية وأنها تتفاعل بسرعة أكبرللضغوطات 10. A. يجب أن تكون مثقفة المكسيكي في النظم المائية في ظل ظروف منظمة بعناية من تدفق المياه، درجة الحموضة، الموصلية، الضغط التناضحي، والإضاءة، ودرجات حرارة المياه.
في مختبر جيفري، يتم الحفاظ على الأسماك في نظامين للمياه الجارية: (1) “نظام الطفل” للأسماك البالغة الصغيرة قبل النضج الجنسي و (2) نظام الكبار (أو الرئيسي) للبالغين الناضجين جنسيا. ويتكون “نظام الأطفال” من خزانات 8 لتر و 15 لتر مزودة بالمياه الجارية. يتم زرع “نظام الطفل” عن طريق الزريعة والأحداث الشباب المتحولين الذين يزرعون من اليرقات في خزانات أصغر (1-10 لتر) ، حيث يتم تبادل المياه أسبوعيا. تعتمد اليرقات والقلي والأحداث بشكل كبير على الطعام ويجب إطعامهم طعاما حيا (جمبري ملحي) مرة واحدة في اليوم لضمان معدل عال من البقاء على قيد الحياة. ويوضع الأحداث الصغار من “نظام الأطفال” في نظام البالغين بعد حوالي سنة إلى 1.5 سنة. في البداية ، يتم إطعامهم رقائق رباعية المسحوق ، وبعد مزيد من النمو يتم نقلهم إلى نظام تغذية البالغين العادي. ويمكن تقييم النضج الجنسي من خلال حجم البطن في الإناث، وقد وصفت أساليب لتحديد الجنس11. في نظام البالغين، يتم تبادل المياه تلقائيا في 42 خزان لتر 3 مرات لكل 24 ساعة. يتم مراقبة نظام البالغين يوميا من خلال الفحص البصري ودرجة الحرارة التلقائية ودرجة الحموضة وقراءات التوصيلية من المسابير. درجة الحموضة المثلى حوالي 7.4 ويمكن أن تتراوح بين 6.8-7.5، ودرجة الحرارة الأساسية للنظام هو 72/73 درجة فهرنهايت، والموصلية المثالية تتراوح بين 600-800 متر. يتم إجراء فحوصات مستقلة على جودة المياه أسبوعيا من خلال اختبار درجة الحرارة وقياس معايير جودة المياه لhh والأمونيا والنترات باستخدام اختبار colorimetric. يتم الاحتفاظ مستويات الأمونيا والنترات عند أو بالقرب من الصفر بإضافة البكتيريا المفيدة (مثل، دورة نوتافين) إلى النظام. يتم التحكم في إضاءة الغرفة بواسطة مؤقت يتم ضبطه على فترات ضوئية مدتها 14 ساعة و10 ساعات مظلمة. بالإضافة إلى معايير جودة المياه الشاملة المذكورة أعلاه، فإن الاعتبارات التالية تحتاج إلى اهتمام خاص خلال أسبوع التربية.
الاعتبار الأول هو photoperiod ، والأسماك (حتى الأسماك كهف في المختبر) تعتمد على دورات الضوء لضبط الساعة circadian بهم. يمكن أن تؤثر الإيقاعات الإيقاعية على كل شيء من التربية والتغذية إلى صحة الجهاز المناعي12و13 ويجب أن تكون متسقة لتحقيق أقصى قدر من الفوائد الصحية. يتم الحفاظ على الأسماك في نظام المياه الجارية على ضوء 14 ساعة و 10 ساعة ضوئية داكنة. تبدأ الأسماك السطحية بشكل عام في التفريخ بعد ساعة من سواد النظام ، ويمكن للضوء الذي تم إدخاله خلال هذه الفترة أن يتداخل مع التفريخ وينهيه. تفريخ أسماك الكهوف العمياء أقل إزعاجا من الضوء. وبالمقارنة مع تفريخ الأسماك السطحية، يتأخر تفريخ أسماك الكهوف، وعادة ما يبدأ بعد أربع إلى خمس ساعات من سواد النظام.
والاعتبار الثاني هو التغذية. وعادة ما تتغذى الأسماك البالغة اتباع نظام غذائي من رقائق رباعية مرة واحدة في اليوم. قبل التفريخ، يتم تغذية الأسماك بنظام غذائي غني بالبروتين تكمله كميات إضافية من رقائق رباعية وغيرها من المواد الغذائية: رقائق صفار البيض والديدان السوداء كاليفورنيا الذين يعيشون في بعض الأحيان(Lumbriculus variegatus)للتعويض عن فقدان البروتين بسبب إنتاج البيض خلال دورة التفريخ السابقة. خلال أسبوع التربية، يتم تغذية الأسماك مرتين في اليوم، مرة في الصباح ومرة أخرى في فترة ما بعد الظهر / المساء. وينبغي تجنب تغذية الأسماك مرة واحدة فقط في اليوم ولكن مع جزء واحد كبير جدا من الغذاء، لأن هذا يمكن أن يسبب سوء التغذية14.
الاعتبار الثالث هو الفضاء. وتستند متطلبات الفضاء على متوسط كتلة الجسم من الكبار، فضلا عن الاعتبارات السلوكية، مثل ما إذا كان الأسماك لديها سلوك التعليم أو السلوك العدواني. يمكن أن تؤدي الدبابات المفرطة أو الناقصة إلى زيادة العدوان والإجهاد المستمر ، مما يجعل الأسماك عرضة للإصابة من زملائها في الدبابات ومترددة في المشاركة في تفريخ15. نحن عادة منزل 10-20 الأسماك لكل خزان 42 لتر.
النظر الرابع هو درجة الحرارة. كما ذكر أعلاه، الأسماك بدم بارد وتعتمد على البيئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. لأن درجة الحرارة لها تأثير مباشر على عمليات التمثيل الغذائي، يمكن أن تؤدي التغيرات في درجة الحرارة إلى تغييرات سلوكية في الأسماك16. يتكون برنامج التربية هذا من دورات لمدة أسبوعين في درجة الحرارة: الأسبوع الأول يدخل ارتفاع درجة الحرارة إلى 78 درجة فهرنهايت ، ويحافظ الأسبوع التالي على درجة حرارة ثابتة تبلغ 72 درجة فهرنهايت. خلال الأسبوع الأول (التربية) ، يتم وضع شبكات التربية ذات الحواف البلاستيكية في الجزء السفلي من الخزانات كل مساء. وتستخدم شباك التربية كحاجز بين الأسماك الموجودة في الخزانات والبيض المفرخ، الذي كان سيستهلك لولا ذلك. يتم رفع درجة الحرارة بمقدار درجتين فهرنهايت في اليوم إلى 78 درجة فهرنهايت كحد أقصى بحلول منتصف الأسبوع ، ويتم تحريض التفريخ وفقا لدورة الضوء في أول 2-3 أمسيات من هذا الأسبوع. ثم يتم تخفيض درجة الحرارة بمقدار درجتين فهرنهايت إلى 72 درجة فهرنهايت خلال الأيام المتبقية من الأسبوع، ويتم الحفاظ على درجة الحرارة الأساسية حتى بداية أسبوع التكاثر التالي. وعادة ما يتم تحفيز تربية ما لا يزيد عن مرتين في الشهر للسماح للأسماك الوقت لاسترداد.
وعموما، تسمح هذه الطريقة بتكاثر كميات كبيرة من الأجنة عالية الجودة على مدى فترة زمنية أطول.
Protocol
Representative Results
Discussion
Astyanax mexicanus هو نموذج بيولوجي جديد يولد بشكل متكرر ويمكن تربيته بسهولة في المختبر1،2. ولأننا مهتمون بالآليات التنموية التي تكمن وراء التغيرات التطورية في أسماك كهف أ. المكسيكية، فإن إنتاج واستخدام الأجنة أمر حيوي لأهدافنا البحثية. والغرض الرئيسي من …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ديفيد مارتاسيان، ديدري هيسر، إيمي باركهورست، كريغ فوت، وماندي نغ على المساهمات القيمة في مختبر جيفري A. mexicanus مرفق الثقافة. ويدعم البحث في مختبر جيفري حاليا من قبل المعاهد القومية للصحة منحة EY024941.
Materials
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
- Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).
- Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
- Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
- O’Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
- Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
- Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
- Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
- Borowsky, R. . Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , (2008).
- Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
- Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
- Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
- Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
- Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
- Borowsky, R. . In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , (2008).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
- Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
- Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
- Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
- Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).
