Метаболическое профилирование для определения бактерицидных или бактериостатические эффекты новых натуральных продуктов с использованием изотермальной микрокалориметрии
Summary
Выяснение способа действия нового антибиотика является сложной задачей в процессе обнаружения наркотиков. Целью метода, описанного здесь, является применение изотермальной микрокалориметрии с использованием calScreener в антибактериальном профилировании для обеспечения дополнительного понимания взаимодействий между наркотиками и микробами.
Abstract
В связи с глобальной угрозой повышения устойчивости к противомикробным препаратам срочно необходимы новые антибиотики. Мы исследуем натуральные продукты myxobacteria как инновационный источник таких новых соединений. Одним из узких мест в этом процессе, как правило, является выяснение их способа действия. Недавно мы создали изотермальную микрокалориметрию в рамках обычного профилирования трубопровода. Эта технология позволяет исследовать влияние воздействия антибиотиков на общую бактериальную метаболическую реакцию, включая процессы, которые отделены от образования биомассы. Важно отметить, что бактериостатические и бактерицидные эффекты легко различимы без какого-либо вмешательства пользователя во время измерений. Тем не менее, изотермальная микрокалориметрия является довольно новым подходом, и применение этого метода к различным бактериальным видам обычно требует предварительной оценки подходящих условий измерения. Есть некоторые эталонные термограммы, доступные некоторых бактерий, значительно облегчая интерпретацию результатов. Поскольку пул справочных данных неуклонно растет, мы ожидаем, что методология будет иметь все большее влияние в будущем, и ожидаем, что она позволит продать углубленный анализ отпечатков пальцев, позволяющий дифференцировать классы антибиотиков.
Introduction
Цель этого метода заключается в применении изотермальной микрокалориметрии (IMC) в качестве средней пропускной способности анализа в режиме действия (MOA) профилирования новых антибактериальных соединений. Этот метод раскрывает данные о активности соединений на бактериальных видах и предоставляет информацию о бактерицидной или бактериостатической природе самого соединения.
Рост формирующейся устойчивости к противомикробным препаратам (АМР) является глобальной проблемой, и это приводит к менее эффективному лечению распространенных инфекций с известнымиантибиотиками 1. Однако поиск новых соединений и лекарств, которые могут заменить или работать в сочетании с известными антибиотиками, продолжается, и это построено на различных подходах. Натуральные продукты являются ключевым игроком в текущих кампаниях по обнаружению наркотиков и, в частности, в обнаружении противоинфекционыхпрепаратов 2. Тем не менее, выявление новых свинцовой структуры для разработки антибиотиков является длительным и финансово требовательнымпроцессом 3. Таким образом, первые шаги открытия чрезвычайно важны для того, чтобы фильтровать на самых перспективных эшафотах уже на ранней стадии. Первоначальные шаги в открытии природного продукта наркотиков включают получение структуры соединения, определение активности в пробирке вместе с МОА и целевой идентификации. Большинство успешных соединений, имеющих право на дальнейшее развитие, должны отображать благоприятный спектр деятельности (т.е. активность широкого спектра в случае антибактериальных препаратов) и новый МОА, с помощью которого можно преодолеть уже существующие АМР. Перспективные леса, то, как правило, скрининг в вторичных анализов, которые включают в себя в vivo биодоступности, токсичности и метаболизма4. Помимо финансовых проблем, открытие природного продукта наркотиков сталкивается с дальнейшими проблемами, касающимися затрат и технических трудностей, связанных с сложной изоляцией и очисткой, что, в свою очередь, может сделать его трудным для получения нескольких миллиграммов или даже граммов суммы на ранних стадияхпроцесса открытия 5,6. Поэтому крайне важно в исследованиях натуральных продуктов иметь возможность проводить самый современной первичный скрининг с минимальными составными количествами, чтобы принять обоснованное решение о дальнейших инвестициях, чтобы сделать новый натуральный продукт доступным для доклинического развития. С использованием IMC для антибактериального профилирования, количество необходимых соединений значительно уменьшается по сравнению со стандартными методами. Техника также предоставляет более подробную информацию о взаимодействии новых препаратов с микробным сообществом7.
ММК является устоявшимся методом измерения общей энергии в результате всех биологических, физических и биохимических процессов и реакций в биологической системе. Высвобождение бактериальной энергии пропорционально общей метаболическойреакции 8. В закрытой системе, такой как используемый микрокалориметр, уровень тепла может быть измерен в диапазоне микроватт для изучения метаболическойкинетики бактерий 9,,10,,11,,12. Тепло (энергия), которое высвобождается бактериями, связано с клеточными функциями, которые лежат в основе их метаболизма и которые не обязательно пропорциональны клеточной биомассе.
Первоначально применимость изотермальной калорийности для микробиологических анализов была ограничена из-за низкой пропускной способности и высоких объемов испытаний. Тем не менее, используемый микрокалориметр уникален, поскольку он сочетает в себе преимущества изотермальной калорийиметрии с повышенной пропускной способностью и более низкими требованиями соединения, что делает его ценным инструментом для примененияобнаружения наркотиков 10. Кроме того, прибор предоставляет дополнительные преимущества по сравнению с альтернативными методами измерения кинетики роста бактерий, такими как стандартный метод мутности, который основан на измерении оптической плотности на уровне 600 нм (OD’lt;600). Измерение OD600 основано на предположении, что повышенная оптическая плотность равна росту микробов, тем самым пренебрегая наличием нежизнеспособных клеток. Этот метод также был подвергнут критике, поскольку он исключает небольшие варианты колонии и сохраняемыеклетки 11. В отличие от этого, IMC позволяет в режиме реального времени наблюдения любого типа жизнеспособных клеток. Если клетки находятся в состоянии покоя, они по-прежнему проявляют метаболическую активность, и таким образом они могут быть обнаружены IMC, в то время как такие явления не обнаруживаются стандартным методоммутности 11. Другие преимущества IMC включают более короткое время тестирования на противомикробную восприимчивость, измерение взаимодействия с наркотиками в сложном сообществе и стандартные методы анализа без уничтожения образца7.
Технология IMC была внедрена в широком диапазоне исследований, начиная от микробиологии до термогенезаи биологии рака 13,,14,,15,,16,,17. Микробные применения включают определение минимальных ингибирующие концентрации (MIC) соединений против различных бактериальных штаммов. Было проведено несколько исследований, и был сделан вывод о том, что данные МИЦ из изотермальной калорийиметрии для большинства видов бактерий могут быть получены быстрее и результаты аналогичны другим (стандартным) методам определения MIC12,,18,19. Дальнейшее применение IMC включает наблюдение за взаимодействием препаратов и сочетание медикаментозного лечения со сложными бактериальными сообществами, такими какбиопленки 11. Исследование, сосредоточенное на профилировании МОА, показало, что микрокалориметр может обнаружить разницу в цефалоспоринах первого и второго поколения, в то время как различные антибиотики с тем же МО обладают аналогичной кривой теплового потока по сравнению друг сдругом 18.
Здесь мы описываем использование IMC для moA профилирования новых натуральных продуктов с использованием нового изотермального инструмента микрокалориметрии. Метод используется для определения эффективных концентраций антибиотиков и описания характеристик антибиотиков с точки зрения бактерицидных или бактериостатические механизмы. Этот метод может быть широко внедрен в профилировании соединений МОА и может заменить или, по крайней мере, дополнить стандартные микробиологические методы. Будущие исследования будут включать углубленный анализ отпечатков пальцев, который позволит дифференцировать классы антибиотиков на основе целевых механизмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изотермальная микрокалориметрия измеряет энергию, выделяемую из образца с течением времени, и этот выброс энергии является результатом всех биологических, физических и (био-) химических процессов. Измеренный тепловой поток может быть использован для оценки или определения антибактериального воздействия веществ, поскольку он позволяет непрерывно контролировать метаболическую активность в режиме реального времени.
Для получения достоверных данных для анализа необходимо определить корректные стартовые единицы формирования колоний (КФУ) индивидуально для каждого используемого вида или штамма. В случае, если количество CFU слишком низко, это приводит к длительной фазе отставания, поскольку система занимает больше времени, чтобы достичь критического количества биомассы, производящей достаточно тепла для обнаружения. В случае, если количество CFU слишком высока, фаза задержки будет очень короткой, а произведенное количество тепла может привести к передаче тепла соседним сенсорным ячейкам (справочным и экспериментальным скважинам) и вызвать искажения термограмм. Большое количество CFU также приведет к более быстрому истощению кислорода и перейти к анаэробных условиях. Следует также учитывать, что в течение первых 30 минут эксперимента, когда система эквилибрирует, сбор данных не представляется возможным, а фактическая запись эффектов задерживается. Кроме того, неправильное определение CFU приводит к ложному определению MIC, в конечном счете, влияющих на эксперимент и изменения,наблюдаемые 25. Другим критическим моментом является правильное определение базовой линии. Как правило, базовый сигнал выбирается во время фазы отставания, когда сигнал теплового потока равна нулю и в идеале, диапазон времени для базового определения составляет 30 мин. Однако это не всегда возможно, так как время, необходимое бактериям для достижения предела обнаружения теплового сигнала, различается между штаммами и видами. Некоторым видам или штаммам требуется более 30 минут, чтобы достичь предела обнаружения теплового сигнала, в то время как другие штаммы или виды достигают его в течение первых 30 минут. В этом случае можно выбрать базовый сигнал в конце эксперимента, когда все тепловые сигналы упали обратно к нулю и остаются стабильными. Кроме того, базовые показатели от других экспериментов с тем же бактериальным штаммом могут быть использованы, который, однако, не рекомендуется.
Система обеспечивает некоторую гибкость в плане проектирования и оптимизации экспериментов и устранения неполадок. Используемые объемы находятся в диапазоне 100-300 йл при использовании пластиковых вставок и 100-600 МКЛ при использовании титановых стаканчиков без пластиковых вставок. Рекомендуемый производителем рабочий объем составляет 120 мл. Использование различных объемов при создании новой экспериментальной серии и при поиске оптимальных условий для измерений оказывает влияние главным образом на два параметра. Используя более низкие объемы, количество требуемого испытательного соединения может быть уменьшено, что особенно важно для соединений, которые доступны только в небольших количествах. Кроме того, используемый объем непосредственно влияет на доступность кислорода во время измерения с более низкими объемами, увеличивая количество доступного кислорода, необходимого для роста бактерий. Истощение кислорода является одним из основных факторов, способствующих максимально возможной продолжительности эксперимента. Важно отметить, что можно использовать твердые средства массовой информации, а не только жидкие средства массовой информации. Это особенно важно для медленно растущих микроорганизмов, так как рост на стыке твердой и газовой фазы обеспечивает лучший доступ к кислороду9.
IMC является полезным аналитическим инструментом для обнаружения неизвестных процессов с приложениями в физике, химии и биологии. Метод измеряет теплообмеся в закрытой системе, а анализ записанного теплообмесяя предоставляет дополнительную информацию, которую не всегда можно получить стандартными методами. В исследованиях микробиологии и антибиотиков, одним из самых больших преимуществ IMC является его способность различать живые, мертвые и упорствующие или спящие клетки, что невозможно с помощью стандартных методовмутности 11. Кроме того, IMC является высокочувствительным и он может обнаружить тепловые выбросы от всего лишь 104-105 клеток 9. Еще одним преимуществом является то, что экспериментальная установка быстро и легко, и это позволяет непрерывное, в режиме реального времени отслеживания с минимальным без вмешательства пользователя. Кроме того, ММК не является деструктивным, что позволяет проводить дальнейший анализ образцов. Анализ данных позволяет отделить образование биомассы до поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазы и метаболической активности в стационарной фазе.
Помимо новых и интересных функций приложения, упомянутых выше, Есть также недостатки этого метода. Основным ограничением является то, что приборы ММК измеряют общее тепло, производимое и высвобождаемое в рамках конкретной системы, которые также включают неспецифические сигналы. Это подчеркивает важность экспериментального планирования с соответствующими управлениями, чтобы иметь возможность оценить изменения теплового сигнала, которые измеряются путем записитеплового потока 9,20.
В наших руках IMC является важным инструментом для изучения антибактериального воздействия новых натуральных продуктов и определения эффективных диапазонов концентрации. Помимо дифференциации бактериостатических и бактерицидных эффектов, он может быть использован в будущем в рамках целевых исследований идентификации и определения МОА. Это можно сделать, сравнив термограммы различных классов антибиотиков с термограммами новых активных соединений, как показано здесь. Однако еще предстоит иззнать, достаточны ли для таких сопоставлений определенные поддающиеся количественной оценке параметры, которые могут быть извлечены из измеренных данных, или же необходимо будет работать над алгоритмами, дающие отпечатки пальцев на основе полных термограмм. Другим возможным применением в области исследований антибиотиков является сравнение дикого типа с устойчивыми клонами в сочетании с секвенированием всего генома, которое может помочь выяснить режим устойчивости (MOR) новых антибактериальных препаратов. Из-за статического характера метода, исследование эффективности новых агентов либо на биопленку формирования или на уже установленных биопленок может привести к лучшему пониманию биологического процесса и влияние отдельных агентов на микробы на различных стадиях покоя. IMC записывает общую энергию, выпущенную в виде тепла, что делает его подходящим методом для исследования также суб-ингибирующее воздействие активных веществ, которые могут быть соединены с транскриптомикой. Этот метод также может быть использован в клинических условиях для обнаружения загрязнения образцов или для определения антибиограмм, помогающих быстро принять решение о точномлечении пациентов 11.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить команду Symcel за плодотворные дискуссии, и мы хотели бы отметить большую поддержку со стороны Ганны Олийнык и Вильгельма Пауландера. Мы также хотели бы поблагодарить Даниэля Конхойзера за предоставление натурального продукта и Стефани Шмидт за искусную техническую поддержку.
Materials
| Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
| calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
| calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
| calView software | Symcel | collection and analysis software | |
| calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
| CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
| Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
| Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
| Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
| Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
| Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
| Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
| Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
| Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
| Pipette 100 – 1000 µL | Brand | 705880 | |
| Pipette 2 – 20 µL | Brand | 705872 | |
| Pipette 20 – 200 µL | Brand | 705878 | |
| Pipette tips 100 – 1000 L | Brand | 732032 | |
| Pipette tips 2 – 200 µL | Brand | 732028 | |
| Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
| Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
| Sterile filters | Minisart | 16534———-K | 0.2 µm pore size sterile filters |
| Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
| Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
| Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
| Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
| Tweezers | Symcel | 1900602 |
References
- Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance (2018)
- Herrmann, J., Abou Fayad, A., Müller, R. Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities. Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).
- Cassar, S., et al. Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Bhusnure, O. G., et al. Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool. Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).
- Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products. Using Old Solutions to New Problems – Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).
- Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. Fishing for Nature’s Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).
- Antimicrobial Development. Symcel Available from: https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development (2019)
- Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions. Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).
- Braissant, O., Wirz, D., Göpfert, B., Daniels, A. U. Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities. FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).
- Braissant, O., et al. Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay. Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).
- Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment. Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).
- Tellapragda, C., et al. Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli – A multicenter study. Clinical Microbiology and Infection. , (2020).
- Abdillahi, S., et al. Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity. The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).
- Astasov-Frauenhoffer, M., et al. Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms. PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).
- Gros, S., et al. Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).
- Kriszt, R., et al. Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Wadsö, I., et al. A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues. Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).
- von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. Isothermal micro calorimetry – a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus. BMC Microbiology. 9 (106), (2009).
- Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species. Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).
- Wadsö, I. Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).
- LeBel, M. Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions. Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).
- Chopra, I., Roberts, M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).
- Allison, J. L., et al. Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).
- Wehrli, W. Rifampin: mechanisms of action and resistance. Reviews of Infectious Diseases. 5, 407-411 (1983).
- Hancock, R. E. W., et al. Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).
