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Bioengineering

Perfil metabólico para determinar efeitos bacteriáticos ou bacteriostáticos de novos produtos naturais usando microcalorimetria isotérmica

Published: October 29, 2020
doi:
10.3791/61703
, , ,
1Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland, Department of Microbial Natural Products, Helmholtz Centre for Infection Research and Department of Pharmacy,Saarland University, 2Partner Site Hannover-Braunschweig,German Centre for Infection Research (DZIF)

Summary

A elucidação do modo de ação de um novo antibiótico é uma tarefa desafiadora no processo de descoberta de medicamentos. O objetivo do método descrito aqui é a aplicação de microcalorimetria isoteral usando calScreener em perfil antibacteriano para fornecer informações adicionais sobre interações medicamentoso-micróbios.

Abstract

Devido à ameaça global de aumento da resistência antimicrobiana, novos antibióticos são urgentemente necessários. Investigamos produtos naturais da Myxobacteria como uma fonte inovadora de tais novos compostos. Um gargalo no processo é tipicamente a elucidação de seu modo de ação. Recentemente estabelecemos microcalorimetria isoteérmica como parte de um oleoduto de perfil de rotina. Esta tecnologia permite investigar o efeito da exposição a antibióticos na resposta metabólica bacteriana total, incluindo processos que são dissociados da formação de biomassa. É importante ressaltar que os efeitos bacteriostáticos e bactericidas são facilmente distinguíveis sem qualquer intervenção do usuário durante as medições. No entanto, a microcalorimetria isotérmica é uma abordagem bastante nova e aplicar este método a diferentes espécies bacterianas geralmente requer pré-avaliação de condições de medição adequadas. Existem alguns termogramas de referência disponíveis de certas bactérias, facilitando muito a interpretação dos resultados. Como o pool de dados de referência está crescendo constantemente, esperamos que a metodologia tenha um impacto crescente no futuro e esperamos que ela permita análises aprofundadas de impressões digitais que permitam a diferenciação das classes de antibióticos.

Introduction

O objetivo deste método é aplicar a microcalorimetria isotérmica (IMC) como um ensaio de rendimento médio no perfil do modo de ação (MoA) de novos compostos antibacterianos. Este método revela dados sobre a atividade de compostos em espécies bacterianas e fornece informações sobre a natureza bactericida ou bacteriostática do próprio composto.

O aumento da resistência antimicrobiana emergente (AMR) é um problema global e leva a tratamentos menos eficazes de infecções comuns com antibióticos conhecidos1. No entanto, a busca por novos compostos e medicamentos que possam substituir ou trabalhar em combinação com antibióticos conhecidos está em andamento e isso é construído em diversas abordagens. Os produtos naturais são um ator-chave nas campanhas atuais de descoberta de drogas e particularmente na descoberta de drogas anti-infecciosas2. No entanto, identificar novas estruturas de chumbo para o desenvolvimento de antibióticos é um processo demorado e financeiramente exigente3. Assim, os primeiros passos da descoberta são extremamente importantes para filtrar os andaimes mais promissores já em estágio inicial. As etapas iniciais na descoberta de medicamentos para produtos naturais incluem a obtenção da estrutura de um composto, determinação da atividade in vitro juntamente com o MoA e identificação de alvos. A maioria dos compostos bem-sucedidos elegíveis para o desenvolvimento adicional deve exibir um espectro favorável de atividade (ou seja, atividade de amplo espectro no caso de antibacterianos) e um novo MoA pelo qual a AMR pré-existente pode ser superada. Andaimes promissores são, então, tipicamente examinados em ensaios secundários, que incluem biodisponibilidade in vivo, toxicidade e metabolismo4. Além das preocupações financeiras, a descoberta de medicamentos para produtos naturais enfrenta ainda mais desafios em relação aos custos e dificuldades técnicas relacionadas ao isolamento e purificação compostos, o que, por sua vez, pode dificultar a obtenção de quantidades multiimilíficas ou até mesmo gramas nos estágios iniciais do processo de descoberta5,,6. Portanto, é de extrema importância na pesquisa de produtos naturais poder realizar a triagem primária de última geração com quantidades mínimas de compostos, a fim de tomar uma decisão bem informada sobre novos investimentos para tornar um novo produto natural acessível para o desenvolvimento pré-clínico. Com o uso de IMC para perfil antibacteriano, a quantidade de composto necessário é significativamente reduzida em comparação com os métodos padrão. A técnica também fornece informações mais aprofundadas sobre a interação de novos fármacos com a comunidade microbiana7.

O IMC é um método bem estabelecido para medir a energia total como resultado de todos os processos e reações biológicas, físicas e bioquímicas em um sistema biológico. A liberação de energia bacteriana é proporcional às reações metabólicas totais8. Dentro de um sistema fechado, como o microcalímetro utilizado, os níveis de calor podem ser medidos na faixa de microwatts para estudar a cinética metabólica das bactérias9,,10,,11,,12. O calor (energia) que é liberado por bactérias está ligado a funções celulares que sustentam seu metabolismo e que não são necessariamente proporcionais à biomassa celular.

Inicialmente, a aplicabilidade da calorimetria isotérmica para ensaios microbiológicos foi limitada devido ao seu baixo rendimento e alto volume de teste. No entanto, o microcalímetro usado é único, pois combina as vantagens da calorimetria isotérmica com o aumento da produtividade e exigências compostas mais baixas, o que o torna uma ferramenta valiosa para aplicações de descoberta de drogas10. Além disso, o instrumento oferece mais vantagens sobre métodos alternativos de medição da cinética de crescimento bacteriano, como o método padrão de turbidez, que se baseia na medição da densidade óptica a 600 nm (OD<600). A medição do OD600 baseia-se no pressuposto de que o aumento da densidade óptica é igual ao crescimento microbiano, negligenciando assim a presença de células não viáveis. Este método também tem sido criticado por excluir pequenas variantes de colônias e células persistência11. Em contraste, a IMC permite a observação em tempo real de qualquer tipo de células viáveis. Se as células estão dormentes, elas ainda apresentam atividade metabólica e podem, assim, ser detectadas pelo IMC, enquanto tais fenômenos não são detectáveis pelo método padrão de turbidez11. Outras vantagens da IMC incluem um tempo de teste de suscetibilidade antimicrobiana mais curto, medir interações medicamentosas em uma comunidade complexa e métodos de análise padrão sem destruir a amostra7.

A tecnologia IMC foi implementada em uma ampla gama de estudos, que vão desde microbiologia até termogênese e biologia do câncer13,,14,,15,,16,,17. As aplicações microbianas incluem a determinação de concentrações inibitórias mínimas (MIC) de compostos contra várias cepas bacterianas. Vários estudos foram feitos e concluiu-se que os dados mic da calimemetria isotérmica para a maioria das espécies bacterianas podem ser obtidos mais rapidamente e os resultados são semelhantes em comparação com outros métodos (padrão) para a determinação do MIC12,,18,,19. Outras aplicações da IMC incluem observar a interação de medicamentos e a combinação de tratamentos medicamentosos com comunidades bacterianas complexas, como biofilmes11. Um estudo com foco no perfil do MoA mostrou que o microcalorímetro pode detectar uma diferença nas cefalosporinas de primeira e segunda geração, enquanto diferentes antibióticos com o mesmo MoA exibem uma curva de fluxo de calor semelhante em comparação entresi 18.

Aqui, descrevemos o uso de IMC para perfil de MoA de novos produtos naturais usando o novo instrumento de microcalorimetria isotérmica. O método é usado para determinar concentrações eficazes de antibióticos e para descrever características de antibióticos em termos de mecanismos bacteriáticos ou bacteriostáticos. O método pode ser amplamente implementado no perfil moA de compostos e pode substituir ou pelo menos complementar métodos microbiológicos padrão. Estudos futuros incluirão análises aprofundadas de impressões digitais que permitirão a diferenciação de classes de antibióticos com base em mecanismos-alvo.

Protocol

NOTA: A temperatura do instrumento deve ser definida de acordo com a bactéria usada com pelo menos um dia de antecedência para garantir a estabilidade do sistema. Aqui, as amostras de Acinetobacter baumannii DSM30008 são executadas a 30 °C. 1. Preparação para a cultura Estirpe fora da tensão sob investigação (aqui: A. baumannii) em uma placa DE ágar CASO e incubar durante a noite em uma incubadora estática a 30 °C. Prepare uma cultura noturna inoculando uma única colônia em MHB (caldo Mueller-Hinton) e incubar em uma incubadora a 180 rpm a 30 °C. 2. Preparação da amostra Use tubos de 1,5 mL para preparar a faixa de concentração de droga ou composto selecionado (por exemplo, adicionando 1,5 μL de soluções de estoque de 100x no DMSO; ver o passo 2.3). Diluir a cultura da noite para o dia no meio MHB. Meça a densidade óptica da cultura da noite para o dia usando um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 600 nm. Diluir a cultura para obter 5 x 105 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL em meio MHB fresco. Um OD600 de um equivale a aproximadamente 5 x 108 UFC/mL (por exemplo, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii).NOTA: É importante calibrar o fator de conversão OD600 para CFU/mL para cada cepa bacteriana individual sob as condições de cultivo aplicadas. Adicione 150 μL das células aos tubos de ensaio preparados na etapa 2.1, garantindo a concentração final correta da droga ou composto testado e corrija a concentração final da célula. Misture o composto com as células por vórtice.NOTA: A placa de amostra (ver Tabela de Materiais) possui seis linhas, cada uma contendo oito poços, um total de 48 poços; A linha A e a Linha F são a referência termodinâmica. Portanto, nenhuma amostra pode ser carregada nesses poços, a mídia correspondente é carregada nesses poços. 32 amostras de teste podem ser medidas por corrida, utilizando poços nas linhas B-E. A amostra de ensaio individual deve ser executada no mínimo em duplicata (aqui: todas as amostras foram executadas como triplicados). Os controles de crescimento devem ser incluídos. 3. Inserir preparação Transfira 120 μL da mistura preparada na etapa 2.4 para as pastilhas plásticas.NOTA: Use a tubulação reversa na etapa 3.1 para evitar que o líquido borrife nas laterais das pastilhas plásticas, o que pode levar a interferências com leituras corretas de sinal. Coloque todos os frascos de titânio nos suportes (ver Tabela de Materiais) com pinças. Transfira suavemente as inserções nos frascos de titânio na placa do suporte. Coloque livremente tampas de titânio em todos os frascos de titânio. 4. Inserir carregamento Transfira o suporte com copos de titânio para a estação de amostra e coloque na área designada. Use a chave de torque, fixada em 40 cNm de força, para apertar todas as tampas. 5. Execução de amostras No software calView, inicie um novo experimento(Figura Suplementar 1). Retraia o braço de inserção da amostra do instrumento. Coloque o porta-copos na “ponte”, coluna 8 de frente para a abertura da inserção da amostra e empurre suavemente o porta-copos para dentro do instrumento na “Posição 1” designada. Espere 10 minutos para o sistema estabilizar. Rotule os poços experimentais. Empurre o braço de inserção da amostra até que o porta-copo esteja na “Posição 2” designada. Espere 20 minutos para o sistema estabilizar. Empurre o braço de inserção da amostra para “Posição 3” e retraia o braço de inserção da amostra até que esteja na “posição de execução”. Destaque todos os poços do software e selecione Reaction Start (Figura Suplementar 4). Execute o experimento até que as leituras de emissão de calor sejam de volta a zero.NOTA: Certifique-se de que todos os poços se comportam de forma semelhante dentro dessas etapas. A Figura Suplementar 5 ilustra o que deve ser observado se os poços estiverem carregados corretamente. Se estiver carregado incorretamente, repita as etapas 5.2-5.4. 6. Remova o porta-copos No software, selecione Stop (Figura Suplementar 6). Em seguida, o software perguntará se “você tem certeza”, selecionará Sim (Figura Suplementar 7) e salvará o experimento em uma unidade ou desktop para análise de dados(Figura Suplementar 8). Insira completamente o braço de inserção da amostra no instrumento e engaje os ímãs para recuperar o porta-copos. Solte as tampas, retire as pastilhas e coloque frascos e tampas em suportes de vidro e coloque por 4 horas a 180 °C seguido de colocar os frascos e tampas em um desiccator para garantir que as tampas e os frascos estejam secos. 7. Análise de dados Abra o software(Figura Suplementar 9),selecione Experiência aberta no canto superior esquerdo(Figura Suplementar 10). Na janela pop-up selecione o experimento de interesse e pressione Open (Figura Suplementar 11). O aplicativo abrirá o experimento na exibição de poços padrão(Figura Suplementar 12). Pressione Selecionar todos ou Ctrl+A (Figura Suplementar 13). Pressione Definir linha de base,este parâmetro normaliza os dados em cada posição (Figura Suplementar 14). Na janela pop-up selecione um período de tempo de >30 min localizado na fase de defasagem (o fluxo de calor deve ser baixo, entre zero e dez μW; Figura Suplementar 15). Após a seleção do período de tempo da linha de base, a linha de base escolhida aparecerá em verde no termograma. Feche a janela Definir a seção de linha de base. Pressione Salvar ou Ctrl+S e feche o software(Figura Suplementar 16). Aplicativo de análise de calorimetria Symcel baseado na Web (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/). Para enviar o arquivo para o aplicativo de análise calorimetria, pressione Browse (Figura Suplementar 17),selecione o experimento e pressione Aberto (Figura Suplementar 18). Os parâmetros metabólicos serão calculados automaticamente para as 32 amostras na aplicação web (Figura Suplementar 19). Para encaixar os dados de fluxo de calor aos modelos de crescimento da Gompertz e/ou de Richard, clique em Growth Function. Os modelos de crescimento fit serão exibidos na seção “Cumulativo”, também comparados aos dados brutos da seção “Fluxo”(Figura Suplementar 20). Para baixar todos os parâmetros calculados, pressione Medidas de Download. Selecione o local do arquivo e pressione Salvar (Figura Suplementar 21). O arquivo será exportado para uma planilha para mais cálculos.

Representative Results

Um número suficiente de bactérias que produzem calor é necessário para que o instrumento grave um sinal de calor. Se houver um atraso no tempo até que um fluxo de calor seja detectável, significa que as bactérias ainda não produzem um sinal de calor acima do limite de detecção. A detecção de calor liberado da amostra bacteriana está, portanto, diretamente relacionada ao aumento da atividade bacteriana, incluindo o crescimento bacteriano. O crescimento bacteriano e outras atividades metabólicas são conhecidos por serem fortemente influenciados pela adição de uma droga antibacteriana. Para determinar se um novo produto natural sob investigação exerce efeitos bacteriáticos ou bacteriostáticos ou uma combinação de ambos os MoAs, escolhemos um pequeno conjunto de medicamentos de referência e registramos termogramas aos quais comparamos dados de experimentos com o produto natural. Com base na potência dos antibióticos selecionados, foi selecionada uma série de concentrações sendo próximas da concentração inibitória mínima (MIC) determinada pela diluição de microbroth. Ciprofloxacina tem como alvo o DNA bacteriano gyrase e topoisomerase IV e, consequentemente, exibe um MoA bactericidal. No entanto, a matança bacteriana induzida pela ciprofloxacina é dependente de concentração e quando é dosada em concentrações insuficientes também pode ter um efeito bacteriostático21. Tetraciclina e clororamfenicol miram o ribossomo na subunidade 30S e 50S, respectivamente, e atuam bacteriostáticas devido à inibição da síntese proteica22,23. A rifampicina age inibindo a polimerase de RNA dependente do DNA e pode ter efeitos bacteriáticos e bacteriostáticos, dependendo da dose utilizada24. O produto natural que estamos investigando aqui foi isolado de Myxobacteria e mostrou atividade potente contra patógenos bacterianos Gram-negativos e Gram-positivos. Enquanto investigamos seu MoA e seu alvo molecular, estávamos interessados em determinar se o novo produto natural exerce efeitos bactericidas e/ou bacteriostáticos e se os perfis de calor do tratado Acinetobacter baumannii são semelhantes aos termogramas de bactérias que foram tratadas com os medicamentos de referência mencionados acima. Os termogramas obtidos expondo A. baumannii DSM-30008 à ciprofloxacina em diluição serial são exibidos na Figura 1A. As concentrações entre 0,005 μM e 0,1 μM têm um efeito mínimo sobre o crescimento e o metabolismo de A. baumannii. No entanto, tratar as células com ciprofloxacina de 0,5 μM leva a uma mudança significativa na duração da fase de defasagem e menor fluxo máximo de calor. Essas duas mudanças juntas afetam o tempo de pico(Figura 1C),que é aumentado em aproximadamente 6 horas. Na Figura 1B,o calor liberado cumulativo é plotado contra o tempo. Aqui, vemos o efeito das concentrações, que se refletem por uma inclinação de inclinação. A quantificação da inclinação do termograma nos dá a taxa metabólica máxima de A. baumannii na presença de ciprofloxacina como exibida na Figura 1D,onde podemos observar uma diminuição concomitante da taxa metabólica das células tratadas com ciprofloxacina de 0,5 μM. As alterações da taxa metabólica das células tratadas com concentrações mais baixas são mínimas. Este experimento poderia ser melhorado ainda mais pela adição de concentrações intermediárias que cobrem a faixa de 0,1-1 μM para observar uma mudança gradual mais acentuada entre as concentrações que não têm efeito e uma concentração resultando em um atraso significativo da fase de defasagem e da taxa metabólica. No entanto, as tendências de mudança suportam um MoA bactericidal de ciprofloxacina. Figura 1A: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 1B: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 1C: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 1D: Efeito da ciprofloxacina no crescimento e metabolismo A. baumannii DSM-30008. (A) Termogramas mostrados como fluxo de calor (μW) vs. tempo (h) para tipo selvagem (WT) A. baumannii DSM-30008, não tratado e exposto à ciprofloxacina. (B) Calor cumulativo (mJ) vs. tempo (h). (C) Tempo para pico (h) com barras de erro (desvio padrão). (D) Taxa metabólica (μW) com barras de erro (desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. No caso da tetraciclina, não observamos alterações significativas nos termogramas para todas as concentrações testadas até a fase exponencial tardia a partir das 8 horas (ver Figura 2A). No entanto, grandes mudanças são observadas na emissão de calor em fase estacionária, onde o segundo pico de fluxo de calor é significativamente reduzido para A. baumannii tratado com 5 μM e 10 μM tetraciclina. As concentrações mais baixas também tiveram um efeito, que foi menos pronunciado. Esse efeito também faz com que um prolongamento no tempo aumente conforme exibido na Figura 2C. As curvas de calor liberadas cumulativas(Figura 2B) mostram que as células não tratadas e tratadas não apresentam diferenças significativas na forma geral da curva, mas, por tendência, a inclinação das curvas diminui em concentrações mais elevadas de tetraciclina. Isso também se traduz em taxas metabólicas quantificadas exibidas na Figura 2D,onde observa-se um efeito dependente da concentração (ou seja, diminuição da taxa metabólica no aumento das concentrações de antibióticos). Esses achados apoiam o fato de que a tetraciclina tem um efeito bacteriostático. Figura 2A: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2B: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2C: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2D: Efeito da tetraciclina no crescimento e metabolismo A. baumannii DSM-30008. (A) Termogramas mostrados como fluxo de calor (μW) vs. tempo (h) para tipo selvagem (WT) A. baumannii DSM-30008, não tratado e exposto à tetraciclina. (B) Calor cumulativo (mJ) vs. tempo (h). (C) Tempo para pico (h) com barras de erro (desvio padrão). (D) Taxa metabólica (μW) com barras de erro (desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Efeitos ainda mais pronunciados podem ser observados ao tratar A. baumannii com o inibidor de síntese proteica clororamfenicol que tem como alvo a subunidade ribossômica 50S. A exposição ao aumento das concentrações de clororamfenícol leva ao prolongamento da fase de defasagem e mudanças significativas da atividade metabólica na fase estacionária(Figura 3A e Figura 3B). Nenhuma alteração na taxa metabólica é observada para a menor concentração testada e a maior concentração de teste escolhida (50 μM) impede a maior liberação de energia da amostra. Olhando para as concentrações de teste intermediários (5 μM e 10 μM), o tempo para o pico é significativamente aumentado em aproximadamente 8-9 horas(Figura 3C). Simultaneamente, a taxa metabólica das células tratadas é significativamente reduzida, sendo 50 μM letal(Figura 3D). No geral, as alterações observadas em concentrações de até 10 μM de cloramfenicol são consistentes com um efeito bacteriostático desta classe de antibióticos. Figura 3A: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3B: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3C: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3D: Efeito do clororamfenicol no crescimento e metabolismo A. baumannii DSM-30008. (A) Termogramas mostrados como fluxo de calor (μW) vs. tempo (h) para tipo selvagem (WT) A. baumannii DSM-30008, não tratado e exposto ao clororamfenicol. (B) Calor cumulativo (mJ) vs. tempo (h). (C) Tempo para pico (h) com barras de erro (desvio padrão). (D) Taxa metabólica (μW) com barras de erro (desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. O tratamento com rifampicina na faixa de concentração selecionada tem um efeito dramático nos termogramas de A. baumannii DSM-30008 relacionados à duração da fase de defasagem e efeitos sobre o crescimento até a fase estacionária tardia(Figura 4A). Uma redução significativa da emissão de calor pode ser observada na Figura 4B que acompanha a diminuição da atividade metabólica. A Figura 4C e a Figura 4D ilustram a influência da prolongamento da fase de defasagem e das alterações da atividade metabólica na fase estacionária. A Figura 4C mostra um aumento definitivo no tempo para atingir o pico de todas as concentrações utilizadas. A Figura 4D ilustra a diminuição da taxa metabólica causada pela diminuição da inclinação para todas as concentrações que geralmente são atribuídas a um efeito bactericida. Devido à morte induzida por antibióticos de células bacterianas, espera-se que a atividade metabólica seja menor devido a um número menor de bactérias ativas presentes. Os dados coletados estão de acordo com o fato de que a rifampicina pode atuar bactericida e bacteriostática, e os dados aqui apresentados suportam principalmente efeitos bactericidas das concentrações escolhidas. Figura 4A: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4B: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4C: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4D: Efeito da rifampicina no crescimento e metabolismo A. baumannii DSM-30008. (A) Termogramas mostrados como fluxo de calor (μW) vs. tempo (h) para tipo selvagem (WT) A. baumannii DSM-30008, não tratado e exposto à rifampicina. (B) Calor cumulativo (mJ) vs. tempo (h). (C) Tempo para pico (h) com barras de erro (desvio padrão). (D) Taxa metabólica (μW) com barras de erro (desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A menor concentração de teste selecionada do antibiótico do produto natural (0,25 μM) não tem ou apenas efeitos marginais no termograma de A. baumannii DSM-30008. No entanto, outras concentrações testadas apresentam algum efeito na duração da fase de defasagem, e afetam o crescimento até a fase estacionária tardia(Figura 5A). O efeito mais óbvio é a redução significativa da emissão de calor na fase estacionária. Os dados apresentados na Figura 5B mostram claramente que a energia liberada é significativamente reduzida para todas as concentrações efetivas e a inclinação também é diminuída. Esses efeitos se traduzem em uma diminuição do tempo para o pico (Figura 5C) e, mais importante, observa-se uma diminuição significativa e claramente dependente de dose na taxa metabólica(Figura 5D). A investigação do novo produto natural myxobacteriano revelou um efeito bacteriostático e bactericida combinado. Figura 5A: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5B: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5C: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5D: Efeito de um novo produto natural antibacteriano no crescimento e metabolismo A. baumannii DSM-30008. (A) Termogramas mostrados como fluxo de calor (μW) vs. tempo (h) para tipo selvagem (WT) A. baumannii DSM-30008, não tratado e exposto ao produto natural. (B) Calor cumulativo (mJ) vs. tempo (h). (C) Tempo para pico (h) com barras de erro (desvio padrão). (D) Taxa metabólica (μW) com barras de erro (desvio padrão). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura Suplementar 1: Selecionando um novo experimento na interface de software. Em um quadrado vermelho, o passo para selecionar um novo experimento é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 2: Nomeando um novo experimento na interface do software. Em um quadrado vermelho, o passo para nomear e confirmar que o novo experimento é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 3: Iniciando um novo experimento na interface do software. Em um quadrado vermelho o passo para iniciar um novo experimento é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura suplementar 4: Bem seleção e início de reação na interface de software. Todos os poços de reação são selecionados (poços coloridos na cor azul profundo, botão Selecione tudo retratado em um quadrado vermelho) e o início de reação é selecionado (retratado em um quadrado vermelho). Clique aqui para baixar este número. Figura suplementar 5: Carregamento correto do porta-copos. Os poços de referência são selecionados (cor azul profundo, quadrado vermelho) e os termogramas são exibidos em uma janela pop-up. Quando o carregamento é realizado corretamente, observamos um declínio acentuado no sinal de emissão de calor detectado que deve chegar a uma fase de planalto e permanecer nesta fase por aproximadamente 2-3 minutos, depois o sinal retorna ao ponto de partida. Quando isso é observado, o carregamento do porta-copos está correto. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 6: Fim da experiência. Em vermelho, o botão Stop no experimento é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 7: Confirmação do fim do experimento. Em vermelho, o botão Sim para confirmar o fim do experimento de execução é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 8: Salvando o arquivo de experimento. Uma janela pop-up com opções de arquivo de salvamento é mostrada e em vermelho o botão Salvar é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 9: Interface de software. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 10: Acessando experimentos salvos. Em vermelho, o botão O experimento aberto para acessar experimentos salvos é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 11: Abertura de arquivo de experimento selecionado. Em vermelho, o botão Aberto é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura suplementar 12: Exibição de poços padrão. Todos os termosgramas experimentais e correspondentes são visíveis. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 13: Selecionando poços para análise. Em vermelho, o botão Selecione tudo é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 14: Definindo a linha de base. Em vermelho, o botão Definir a linha de base é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 15: Selecionando o sinal da linha de base. É selecionado o mínimo de 30 minutos de sinal na fase de defasagem (caixa vermelha). Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 16: Salvar alterações no arquivo experimental. Em vermelho, o botão Salvar é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura suplementar 17: Aplicação de análise de calorimetria baseada na Web. A interface de software on-line e o caminho de upload de arquivos são mostrados. Clique aqui para baixar este número. Figura suplementar 18: Upload de arquivo experimental selecionado. Em vermelho, o botão Aberto é retratado. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 19: Análise dos termogramas. Os parâmetros metabólicos calculados para cada poço experimental são retratados em vermelho. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 20: Adequação dos dados experimentais aos modelos teóricos de crescimento. Os dados de fluxo de calor são instalados em um Gompertz ou em um modelo de crescimento de Richard. Clique aqui para baixar este número. Figura Suplementar 21: Exportando as medidas. Em vermelho, os botões Download Measures e Save são retratados. Clique aqui para baixar este número.

Discussion

A microcalorimetria isotérmica mede a energia emitida de um espécime ao longo do tempo e essa liberação de energia é resultado de todos os processos biológicos, físicos e (bio-)químicos. O fluxo de calor medido pode ser explorado para avaliar ou determinar efeitos antibacterianos das substâncias, pois permite o monitoramento contínuo em tempo real da atividade metabólica.

Para obter dados confiáveis para análise, as unidades de formação de colônias (UFC) corretas precisam ser determinadas individualmente para cada espécie ou cepa utilizada. Caso a contagem de UFC seja muito baixa, isso leva a uma fase de defasagem prolongada, pois leva mais tempo para que o sistema atinja uma quantidade crítica de biomassa produzindo calor suficiente para ser detectado. Caso a contagem da UFC seja muito alta, a fase de defasagem será muito curta, e a quantidade de calor produzida pode causar transferência de calor para células sensoriais vizinhas (referência e poços experimentais) e causar distorções dos termogramas. Um alto número de UFC também levará a um esgotamento mais rápido do oxigênio e mudará para condições anaeróbicas. Também deve-se levar em conta que durante os primeiros 30 minutos do experimento, quando o sistema está se equilibrando, a coleta de dados não é possível e o registro real dos efeitos é adiado. Além disso, a determinação incorreta da UFC leva à falsa determinação do MIC, afetando o experimento e as alterações observadas25. Outro ponto crítico é a determinação correta da linha de base. Normalmente, o sinal de linha de base é selecionado durante a fase de defasagem quando o sinal de fluxo de calor é zero e, idealmente, o intervalo de tempo para definição da linha de base é de >30 min. No entanto, isso nem sempre é possível, pois o tempo que a bactéria requer para atingir o limite de detecção de sinal de calor difere entre cepas e espécies. Algumas espécies ou cepas requerem mais de 30 minutos para atingir o limite de detecção de sinal de calor, enquanto outras cepas ou espécies chegam a ela nos primeiros 30 minutos. Nesse caso, é possível selecionar o sinal de linha de base no final do experimento quando todos os sinais de calor caíram para zero e permanecem estáveis. Alternativamente, podem ser utilizadas linhas de base de outros experimentos com a mesma cepa bacteriana, o que, no entanto, não é recomendado.

O sistema permite alguma flexibilidade em termos de design e otimização de experimentos e solução de problemas. Os volumes utilizados estão na faixa de 100-300 μL quando se utiliza de pastilhas plásticas e 100-600 μL ao usar copos de titânio sem as pastilhas plásticas. O volume de trabalho recomendado pelo fabricante é de 120 μL. O uso de diferentes volumes na criação de uma nova série experimental, e ao mesmo tempo em que encontra condições ideais para medições, tem um impacto principalmente em dois parâmetros. Usando volumes mais baixos, a quantidade de composto de teste necessário pode ser diminuída, o que é particularmente importante para os compostos, que estão disponíveis apenas em pequenas quantidades. Além disso, o volume utilizado impacta diretamente a disponibilidade de oxigênio durante a medição com volumes menores aumentando a quantidade de oxigênio disponível necessária para o crescimento bacteriano. O esgotamento do oxigênio é um dos principais fatores que contribuem para a duração máxima possível do experimento. É importante ressaltar que é possível usar mídia sólida, não apenas mídia líquida. Isso é especialmente importante para microrganismos de crescimento lento, pois o crescimento na interface entre a fase sólida e o gás permite um melhor acesso ao oxigênio9.

O IMC é uma ferramenta analítica útil para descobrir processos desconhecidos com aplicações em física, química e biologia. O método mede a troca de calor dentro de um sistema fechado e a análise da troca de calor registrada fornece informações adicionais que nem sempre podem ser obtidas com métodos padrão. Na pesquisa de microbiologia e antibióticos, uma das maiores vantagens da IMC é sua capacidade de distinguir entre células vivas, mortas e pervasas ou dormentes, o que não é possível usando métodos padrão de turbidez11. Além disso, o IMC é altamente sensível e pode detectar emissão de calor de apenas 104-105 células9. Outra vantagem é que a configuração experimental é rápida e fácil, e permite um rastreamento contínuo em tempo real com interferência mínima a nenhuma do usuário. Além disso, o IMC não é destrutivo, o que permite uma análise mais aprofundada das amostras. A análise dos dados permite a dissociação da formação de biomassa até a fase estacionária tardia ou inicial e a atividade metabólica em fase estacionária.

Além dos novos e emocionantes recursos de aplicação mencionados acima, há também desvantagens para este método. A maior limitação é que os instrumentos IMC medem o calor total produzido e liberado dentro de um sistema específico, que também incluem sinais não específicos. Isso destaca a importância do planejamento experimental com controles adequados para poder avaliar as mudanças de sinal de calor que são medidas pelo registro do fluxo de calor9,,20.

Em nossas mãos, a IMC é uma ferramenta importante para estudar efeitos antibacterianos de novos produtos naturais e determinar faixas de concentração eficazes. Além de diferenciar efeitos bacteriostáticos e bactericidas, poderia ser usado no futuro como parte de estudos de identificação de alvos e determinação do MoA. Isso pode ser feito comparando termogramas de diferentes classes de antibióticos com termogramas de novos compostos ativos como mostrado aqui. No entanto, ainda precisa ser investigado se certos parâmetros quantificáveis que podem ser extraídos dos dados medidos são suficientes para tais comparações ou se será necessário trabalhar em algoritmos que dão impressões digitais com base em termogramas completos. Outra possível aplicação no campo da pesquisa de antibióticos é a comparação do tipo selvagem com clones resistentes, juntamente com o sequenciamento do genoma inteiro, que pode ajudar a elucidar o modo de resistência (MoR) de novos antibacterianos. Devido à natureza estática do método, a investigação da eficácia de novos agentes na formação de biofilmes ou em biofilmes já estabelecidos poderia levar a uma melhor compreensão do processo biológico e do efeito dos agentes selecionados sobre micróbios em diferentes estágios de dormência. A IMC registra energia total liberada sob a forma de calor tornando-se um método adequado para investigar também efeitos subibitórios de substâncias ativas que podem ser acoplado à transcriômica. Este método também pode ser usado em ambientes clínicos para detectar contaminação de amostras ou para a determinação de antibiogramas que ajudem a decidir rapidamente sobre o tratamento definitivo dos pacientes11.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer à equipe da Symcel por discussões frutíferas e gostaríamos de reconhecer o grande apoio de Ganna Oliynyk e Wilhelm Paulander. Também gostaríamos de agradecer a Daniel Kohnhäuser por fornecer o produto natural e Stefanie Schmidt por suporte técnico hábil.

Materials

Acinetobacter baumannii DSMZ DSM-30008 reference strain used in this study
calPlate Symcel 1220093 48-well plate for titanium cups to be inserted
calScreener Symcel 1200001 isothermal microcalorimetry instrument
calView software Symcel collection and analysis software
calWell Symcel 1901004 micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups
CASO agar Carl Roth X937.1 isolation and cultivation of microorganisms
Chloroamphenicol Sigma-Aldrich C0378 antibiotic
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850 antibiotic
Cuvettes Brand 759015 1.5 mL cuvettes
Disposable inoculation loops Sarsted 86.1562.050 10 µL inoculation loops
Dimethylsulfoxid (DMSO) Thermo Fisher Scientific 85190
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10428671
Falcon Tubes Sarsted 62.554.502 15 mL falcon tubes
Hydrochloride (HCL) Thermo Fisher Scientific 10316380
Methanol Thermo Fisher Scientific A412-500
Mueller Hinton Broth Sigma-Aldrich 70192 liquid medium for antibiotic susceptibility studies
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media Sigma-Aldrich 90922 Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2
Petri dishes LABSOLUTE 7696404
Pipette 100 – 1000 µL Brand 705880
Pipette 2 – 20 µL Brand 705872
Pipette 20 – 200 µL Brand 705878
Pipette tips 100 – 1000 L Brand 732032
Pipette tips 2 – 200 µL Brand 732028
Polymyxin B sulfate Sigma-Aldrich P0972 antibiotic
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501 antibiotic
Serological pipette Thermo Fisher Scientific 170356N 10 mL Nunc serological pipette
Spectrophotometer Eppendorf AG 6135 000.017
Sterile filters Minisart 16534———-K 0.2 µm pore size sterile filters
Syringe 50 mL NORM-JECT 22778
Tetracycline Sigma-Aldrich 87128 antibiotic
Titanium cups Symcel 1220089 inserted in 48-well titanium calPlate
Titanium lids Symcel 1220091 screwed and tightend to the titanium cups
Trimethroprim Sigma-Aldrich T7883 antibiotic
Tweezers Symcel 1900602
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Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).
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