等熱マイクロカロリメトリーを用いた新天然物の殺菌効果または静電効果を測定する代謝プロファイリング
Summary
新しい抗生物質の作用様式の解明は、創薬プロセスにおける困難な作業である。ここで説明する方法の目的は、抗菌プロファイリングでcalScreenerを使用した等温マイクロカロリメトリーの適用による薬物と微生物の相互作用に関するさらなる洞察を提供することです。
Abstract
抗菌性の上昇という世界的な脅威のために、新しい抗生物質が緊急に必要とされています。このような新しい化合物の革新的な供給源として、ミキソバクテリアの天然物を調査します。プロセスのボトルネックの 1 つは、通常、その動作モードの解明です。我々は最近、定期的なプロファイリングパイプラインの一部として等温マイクロカロリメトリーを確立しました。この技術により、バイオマス生成から分離されたプロセスを含む全細菌代謝反応に対する抗生物質暴露の効果を調査することができます。重要なことに、静菌および殺菌効果は、測定中にユーザーの介入なしに容易に区別可能である。しかし、等温マイクロカロリメトリーはかなり新しいアプローチであり、この方法を異なる細菌種に適用するには、通常、適切な測定条件の事前評価が必要です。特定の細菌の参照温度計がいくつかあり、結果の解釈を大幅に促進します。参照データのプールが着実に増加するにつれて、方法論は今後ますます影響を及ぼすと予想し、抗生物質クラスの分化を可能にする詳細な指紋分析を可能にすることを期待しています。
Introduction
この方法の目的は、新しい抗菌化合物の作用型(MoA)プロファイリングにおいて、中スループットアッセイとして等温マイクロカロリメトリー(IMC)を適用することです。この方法は、細菌種に対する化合物の活性に関するデータを明らかにし、化合物自体の殺菌性または静菌性に関する情報を提供する。
新たな抗菌性(AMR)の台頭は世界的な問題であり、既知の抗生物質1を伴う一般的な感染症の効果的でない治療法につながる。しかし、既知の抗生物質と組み合わせて置き換えたり、働くことができる新しい化合物や薬物の探索が進行中であり、これは多様なアプローチに基づいて構築されています。天然物は、現在の創薬キャンペーンの主要なプレーヤーであり、特に抗感染薬の発見2.しかし、抗生物質開発のための新しいリード構造を特定することは、長く財政的に要求の厳しいプロセス3です。したがって、発見の初期段階は、すでに初期段階で最も有望な足場をフィルタリングするために非常に重要です。天然物創薬の初期段階には、化合物の構造を取得し、MoAおよび標的同定と共にインビトロで活性を決定することを含む。さらなる開発の対象となるほとんどの成功した化合物は、良好な活性スペクトル(すなわち、抗菌薬の場合は広域スペクトル活性)と既存のAMRを克服できる新しいMoAを示すべきである。有望な足場は、通常、生体内の生物学的利用可能性、毒性、および代謝を含む二次アッセイでスクリーニングされる4。経済的な懸念に加えて、天然物創薬は、複合単離と精製に関連するコストと技術的困難に関するさらなる課題に直面しており、これは、発見プロセス55、66の初期段階で複数ミリグラムまたはグラム量を得ることを困難にする可能性がある。したがって、自然産物研究では、臨床前の開発のために新しい天然物をアクセス可能にするために、さらなる投資に関する十分な情報に基づいた意思決定を行うために、最小限の化合物量で最先端の一次スクリーニングを行うことができることは最も重要です。抗菌プロファイリングにIMCを使用すると、標準的な方法と比較して必要な化合物の量が大幅に減少します。この技術はまた、微生物群集7との新薬の相互作用に関するより詳細な情報を提供する。
IMCは、生物学的システムにおける生物学的、物理的、生化学的プロセスおよび反応の結果として、全エネルギーを測定するための確立された方法です。細菌エネルギー放出は、代謝反応全体8に比例する。使用したマイクロカロリメータのような閉系内では、マイクロワット範囲で熱レベルを測定して、細菌99、10、11、1210,11,12の代謝動態を研究することができる。細菌によって放出される熱(エネルギー)は、代謝の根本となる細胞機能に関連しており、必ずしも細胞バイオマスに比例するとは限りません。
当初、微生物学的アッセイに対する等温熱熱量測定の適用性は、その低スループットと高い試験量のために制限されていました。しかし、使用されるマイクロカロリメータは、等温熱熱量測定の利点とスループットの増加と低い化合物要件を兼ね備えているため、ユニークであり、創薬用途10にとって貴重なツールとなる。さらに、この装置は、600nm(OD< 600)における光学密度の測定に基づく標準的な濁度法などの細菌増殖性の運動を測定するための代替方法よりもさらなる利点を提供600する。OD600の測定は、光学密度の増加が微生物増殖と等しいという仮定に基づいて、非生存細胞の存在を無視する。この方法は、小コロニー変異体やパーシスター細胞11を除外するので批判されている。対照的に、IMCはあらゆるタイプの生存細胞をリアルタイムで観察することを可能にする。細胞が休眠状態にある場合、それらはまだ代謝活性を示し、したがってIMCによって検出することができるが、そのような現象は標準的な濁度法11では検出できない。IMCの他の利点は、より短い抗菌感受性検査時間、複雑なコミュニティにおける薬物相互作用およびサンプル7を破壊することなく標準的な分析方法を測定することである。
IMC技術は、微生物学から熱発生、癌生物学,,13、14、15、16、17に至13,14,るまで、幅広い研究に実装されています。151617微生物用途としては、様々な細菌株に対する化合物の最小阻害濃度(MIC)の決定が含まれる。いくつかの研究が行われ、細菌種の大部分に対する等温熱熱量測定からのMICデータをより速く得ることができ、その結果は、MIC決定12、18、19,18,19のための他の(標準)方法と同様であることが結論付けられた。IMCのさらなる応用は、バイオフィルム11のような複雑な細菌群集との薬物治療および薬物治療の組み合わせを観察することを含む。MoAプロファイリングに焦点を当てた研究は、マイクロカロリメーターが第1世代および第2世代のセファロスポリンの違いを検出できることを示したが、同じMoAを有する異なる抗生物質は互いに18と比較して同様の熱流曲線を示す。
ここでは、新しい等温マイクロカロリメトリー装置を用いた新天然物のMoAプロファイリング用IMCの使用について説明する。この方法は、有効な抗生物質濃度を決定し、殺菌または静菌機構の観点から抗生物質の特性を記述するために使用される。この方法は、化合物のMoAプロファイリングで広く実施することができ、標準的な微生物学的方法を置き換えるか、少なくとも補完する可能性があります。今後の研究では、標的メカニズムに基づく抗生物質クラスの分化を可能にする詳細な指紋分析が含まれる。
Protocol
Representative Results
Discussion
等熱マイクロカロリメトリーは、時間の経過とともに標本から放出されるエネルギーを測定し、このエネルギー放出は、すべての生物学的、物理的および(バイオ)化学的プロセスの結果である。測定された熱流量は、代謝活性の連続的なリアルタイムモニタリングを可能にする物質の抗菌効果を評価または決定するために利用することができる。
分析のための信頼できるデータを得るためには、使用される種または株ごとに正しい開始コロニー形成単位(CFU)を個別に決定する必要があります。CFU数が低すぎると、システムが検出するのに十分な熱を生成する重要な量のバイオマスに達するまでに時間がかかるため、遅延フェーズが長くなります。CFUの数が高すぎると、ラグ相が非常に短くなり、生成される熱量が隣接するセンサーセル(基準および実験井戸)への熱伝達を引き起こし、サーモグラムの歪みを引き起こす可能性があります。CFUの数が多いと、酸素の枯渇が速くなり、嫌気性条件に切り替わります。また、実験の最初の30分間、システムが平衡状態にある場合、データ収集が不可能であり、実際の効果の記録が遅れることを考慮する必要があります。また、誤ったCFU判定は誤ったMIC決定につながり、最終的には実験と観察された変化に影響を与える25.もう 1 つの重要なポイントは、ベースラインの正しい決定です。通常、ベースライン信号は、熱流信号がゼロのラグフェーズ中に選択され、ベースライン定義の時間範囲は30分です。しかし、これは、細菌が熱信号検出限界に達するために必要な時間が株と種によって異なるように常に可能であるとは限りません。いくつかの種または株は、他の株または種が最初の30分以内に到達しながら、熱信号検出限界に達するために30分以上を必要とします。その場合、全ての熱信号がゼロに戻って安定した状態で、実験終了時にベースライン信号を選択することができる。あるいは、同じ細菌株を有する他の実験からのベースラインを使用することができるが、これは推奨されない。
システムは実験およびトラブルシューティングの設計および最適化の点でいくらかの柔軟性を可能にする。使用される容積はプラスチックの挿入物を使用するとき100-300 μLおよびプラスチックの挿入なしでチタニウムのコップを使用するとき100-600 μLの範囲である。メーカーが推奨する作業量は120μLです。新しい実験シリーズをセットアップする場合、また測定に最適な条件を見つけると、異なるボリュームを使用すると、主に2つのパラメータに影響を与えます。少量を使用することで、必要な試験化合物の量を減らすことができるので、少量でしか入手できない化合物にとって特に重要です。さらに、使用された容積は、測定中の酸素の供給に直接影響を与え、低い容積は細菌の成長に必要な酸素の量を増加させる。酸素の枯渇は、実験の最大可能な期間に寄与する主な要因の一つです。重要なのは、液体培地だけでなく、固体媒体を用いることが可能である。固体相と気相の界面での成長により酸素アクセスが改善される9が可能となるため、これは成長の遅い微生物にとって特に重要である。
IMCは、物理学、化学、生物学のアプリケーションで未知のプロセスを発見するのに便利な分析ツールです。この方法は、閉じたシステム内の熱交換を測定し、記録された熱交換の分析は、常に標準的な方法では得られない追加情報を提供します。微生物学および抗生物質研究において、IMCの最大の利点の1つは、標準的な濁り法11を使用して不可能である生細胞、死んだ細胞およびパーシスターまたは休眠細胞を区別する能力である。さらに、IMCは感度が高く、わずか10個から10個の4-10セル9から熱放射を検出できる。もう1つの利点は、実験のセットアップが迅速かつ簡単であり、ユーザーの干渉を最小限に抑え、リアルタイムで連続的な追跡を可能にすることです。さらに、IMCは非破壊であり、サンプルのさらなる分析を可能にする。データ解析により、後期指数または初定常相までバイオマス形成の分離と、静止期における代謝活性を可能にします。
上記の斬新でエキサイティングなアプリケーション機能のほかに、この方法には欠点もあります。主な制限は、IMC機器が特定のシステム内で発生し放出される総熱を測定する点です。これは、熱流量9,20を記録することによって測定される熱信号の変化を評価することができる適切な制御を用いた実験計画の重要性を強調する。
私たちの手の中で、IMCは新しい天然物の抗菌効果を研究し、有効な濃度範囲を決定するための重要なツールです。静菌および殺菌効果の区別とは別に、将来的には標的識別研究およびMoA決定の一環として使用される可能性がある。これは、異なる抗生物質クラスのサーモグラムを、ここに表示される新しい活性化合物のサーモグラムと比較することによって行うことができます。しかし、測定されたデータから抽出できる特定の定量化可能なパラメータがそのような比較に十分であるかどうか、または完全なサーモグラムに基づいて指紋を与えるアルゴリズムに取り組む必要があるかどうかはまだ調査する必要があります。抗生物質研究の分野でもう一つの可能な応用は、野生型と耐性クローンの比較であり、全ゲノムシーケンシングと相まって、新しい抗菌薬の抵抗モード(MoR)を解明するのに役立つ。この方法の静的な性質のために、バイオフィルム形成または既に確立されたバイオフィルムに対する新しい薬剤の有効性の調査は、生物学的プロセスのより良い理解と休眠の異なる段階の微生物に対する選択された薬剤の効果につながる可能性があります。IMCは、熱の形で放出される総エネルギーを記録し、転写学に結合される可能性のある活性物質の亜阻害効果も調査するのに適した方法です。この方法はまた、臨床現場で、サンプルの汚染を検出したり、患者11の明確な治療を迅速に決定するのに役立つ抗バイオグラムの決定に使用することができる。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、Symcelのチームの実りある議論に感謝したいと思い、ガンナ・オリイニクとヴィルヘルム・ポーランダーの大きな支援を認めたいと思います。また、ダニエル・クンホイザーが天然製品を提供し、ステファニー・シュミットが巧みな技術サポートをしてくれたことに感謝します。
Materials
| Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
| calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
| calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
| calView software | Symcel | collection and analysis software | |
| calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
| CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
| Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
| Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
| Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
| Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
| Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
| Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
| Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
| Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
| Pipette 100 – 1000 µL | Brand | 705880 | |
| Pipette 2 – 20 µL | Brand | 705872 | |
| Pipette 20 – 200 µL | Brand | 705878 | |
| Pipette tips 100 – 1000 L | Brand | 732032 | |
| Pipette tips 2 – 200 µL | Brand | 732028 | |
| Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
| Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
| Sterile filters | Minisart | 16534———-K | 0.2 µm pore size sterile filters |
| Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
| Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
| Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
| Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
| Tweezers | Symcel | 1900602 |
References
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