Profilazione metabolica per determinare gli effetti batterici o batteriosfondi dei nuovi prodotti naturali utilizzando la microcalorimetria isotermica

Un numero sufficiente di batteri che producono calore è necessario per lo strumento per registrare un segnale di calore. Se c’è un ritardo nel tempo fino a quando un flusso di calore è rilevabile significa che i batteri non producono ancora un segnale di calore al di sopra del limite di rilevamento. La rilevazione del calore rilasciato dal campione batterico è quindi direttamente correlata all’aumento dell’attività batterica, compresa la crescita batterica. Crescita batterica e altre attività metaboliche sono noti per essere fortemente influenzati dall’aggiunta di un farmaco antibatterico. Per determinare se un nuovo prodotto naturale in esame esercita effetti battericistici o batteriostatici o una combinazione di entrambi i MoA, abbiamo scelto un piccolo insieme di farmaci di riferimento e abbiamo registrato termogrammi a cui abbiamo confrontato i dati provenienti da esperimenti con il prodotto naturale. Sulla base della potenza di antibiotici selezionati è stata selezionata una serie di concentrazioni essendo vicino la concentrazione minima inibitoria (MIC) come determinato dalla diluizione microbroth. La Ciprofloxacina si rivolge al DNA batterico gyrase e topoisomerase IV e, di conseguenza, presenta un MoA batterico. Tuttavia, l’uccisione batterica indotta dalla ciprofloxacina è dipendente dalla concentrazione e quando viene dosata a concentrazioni insufficienti può anche avere un effetto batteriostatico21. Tetraciclina e cloràfenfenicolo prendono di mira il ribosoma rispettivamente nella sottounità 30S e 50S, e agiscono batteriostatici a causa dell’inibizione della sintesi proteica22,23. La rifampicina agisce inibendo la polimerasi dell’RNA dipendente dal DNA e può avere entrambi, effetti batterici e batteristatici, a seconda della dose utilizzata24. Il prodotto naturale che stiamo studiando qui è stato isolato da Myxobacteria e ha mostrato una potente attività contro i patogeni batterici Gram-negativi e Gram-positivi. Durante lo studio del suo MoA e bersaglio molecolare, eravamo interessati a determinare se il nuovo prodotto naturale esercita effetti battericitici e/o batteriostatici e se i profili di calore di Acinetobacter baumannii trattati sono simili ai termogrammi dei batteri trattati con i farmaci di riferimento di cui sopra. I termogrammi ottenuti esponendo A. baumannii DSM-30008 alla ciprofloxacina nella diluizione seriale sono visualizzati nella Figura 1A. Le concentrazioni tra 0,005 M e 0,1 M hanno un effetto minimo sulla crescita e sul metabolismo di A. baumannii. Tuttavia, il trattamento delle cellule con 0,5 M ciprofloxacin porta ad un cambiamento significativo nella durata della fase di ritardo e a un minor flusso di calore massimo. Queste due modifiche insieme influiscono sul tempo di picco (Figura 1C), che viene aumentato di circa 6 ore. Nella Figura 1B, il calore cumulativo rilasciato viene tracciato rispetto al tempo. Qui, vediamo l’effetto delle concentrazioni, che si riflette da una pendenza di pendenza. La quantificazione dell’inclinazione del termogramma ci dà il tasso metabolico massimo di A. baumannii in presenza di ciprofloxacina come mostrato nella Figura 1D, dove possiamo osservare una diminuzione concomitante del tasso metabolico delle cellule trattate con 0,5 M ciprofloxacin. I cambiamenti del tasso metabolico delle cellule trattate con concentrazioni più basse sono minimi. Questo esperimento potrebbe essere ulteriormente migliorato con l’aggiunta di concentrazioni intermedie che coprono la gamma di 0,1-1 M per osservare un cambiamento graduale più pronunciato tra le concentrazioni che non hanno alcun effetto e una concentrazione con conseguente ritardo significativo della fase di ritardo e del tasso metabolico. Tuttavia, le tendenze del cambiamento supportano un MoA battericida di ciprofloxacina. Figura 1A: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 1B: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 1C: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 1D: Effetto della ciprofloxacina su A. baumannii DSM-30008 crescita e metabolismo. (A) Termogrammi indicati come flusso di calore (W) rispetto al tempo (h) per il tipo selvaggio (WT) A. baumannii DSM-30008, non trattati ed esposti alla ciprofloxacina. (B) Calore cumulativo (mJ) rispetto al tempo (h). (C) Tempo di picco (h) con barre di errore (deviazione standard). (D) Tasso metabolico (W) con barre di errore (deviazione standard). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nel caso della tetraciclina, non abbiamo osservato cambiamenti significativi nei termogrammi per tutte le concentrazioni testate fino alla fase esponenziale tardiva a partire dopo 8 ore (vedere la figura 2A). Tuttavia, si osservano importanti cambiamenti nelle emissioni di calore in fase stazionaria, dove il secondo picco del flusso di calore è significativamente ridotto per A. baumannii trattato con 5 M e 10 tetraciclina. Anche le concentrazioni più basse hanno avuto un effetto, che è stato comunque meno pronunciato. Questo effetto provoca anche un prolungamento nel tempo di picco come mostrato nella Figura 2C. Le curve di calore cumulative rilasciate (Figura 2B) mostrano che le cellule non trattate e trattate non mostrano differenze significative nella forma complessiva della curva, ma per tendenza, la pendenza delle curve diminuisce a concentrazioni più elevate di tetraciclina. Ciò si traduce anche in tassi metabolici quantificati visualizzati nella figura 2D, dove si osserva un effetto dipendente dalla concentrazione (cioè una diminuzione del tasso metabolico all’aumento delle concentrazioni di antibiotici). Questi risultati supportano il fatto che la tetraciclina ha un effetto batteriostatico. Figura 2A: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2B: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2C: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2D: Effetto della tetraciclina sulla crescita e il metabolismo A. baumannii DSM-30008. (A) Termogrammi indicati come flusso di calore (W) rispetto al tempo (h) per il tipo selvaggio (WT) A. baumannii DSM-30008, non trattati ed esposti alla tetraciclina. (B) Calore cumulativo (mJ) rispetto al tempo (h). (C) Tempo di picco (h) con barre di errore (deviazione standard). (D) Tasso metabolico (W) con barre di errore (deviazione standard). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Effetti ancora più pronunciati possono essere osservati durante il trattamento di A. baumannii con l’inibitore della sintesi proteica chloramphenicol che si rivolge alla sottounità ribosomica 50S. L’esposizione all’aumento delle concentrazioni di cloamfenicolo porta al prolungamento della fase di ritardo e a cambiamenti significativi dell’attività metabolica nella fase stazionaria(Figura 3A e Figura 3B). Non si osserva alcun cambiamento nel tasso metabolico per la concentrazione più bassa testata e la più alta concentrazione di prova scelta (50 M) impedisce la maggior parte del rilascio di energia del campione. Osservando le concentrazioni intermedie di prova (5 M e 10 M), il tempo di picco è notevolmente aumentato di circa 8-9 ore (Figura 3C). Allo stesso tempo, il tasso metabolico delle cellule trattate è significativamente ridotto, con 50 M letali(Figura 3D). Nel complesso, i cambiamenti osservati a concentrazioni fino a 10 clorofenicol di M sono coerenti con un effetto batteriostatico di questa classe antibiotica. Figura 3A: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3B: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3C: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3D: Effetto del clorafenicolo sulla crescita e il metabolismo A. baumannii DSM-30008. (A) Termogrammi indicati come flusso di calore (W) rispetto al tempo (h) per il tipo selvaggio (WT) A. baumannii DSM-30008, non trattati ed esposti al clorafenicol. (B) Calore cumulativo (mJ) rispetto al tempo (h). (C) Tempo di picco (h) con barre di errore (deviazione standard). (D) Tasso metabolico (W) con barre di errore (deviazione standard). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Il trattamento della rifampicina nell’intervallo di concentrazione selezionato ha un effetto drammatico sui termogrammi di A. baumannii DSM-30008 relativi alla durata della fase di ritardo e agli effetti sulla crescita fino alla fase stazionaria tardiva (Figura 4A). Una significativa riduzione delle emissioni di calore può essere visto in Figura 4B che va con una diminuzione dell’attività metabolica. La figura 4C e la figura 4D illustrano l’influenza del prolungamento della fase di ritardo e dei cambiamenti dell’attività metabolica nella fase stazionaria. La figura 4C mostra un aumento preciso del tempo di picco per tutte le concentrazioni utilizzate. La figura 4D illustra la diminuzione del tasso metabolico causata dalla diminuzione della pendenza per tutte le concentrazioni che di solito è attribuita a un effetto battericida. A causa dell’uccisione indotto da antibiotici delle cellule batteriche, l’attività metabolica dovrebbe essere inferiore a causa di un minor numero di batteri attivi presenti. I dati raccolti sono in accordo con il fatto che la rifampicina può agire battericidale e batteriostatico, e i dati qui presentati supportano principalmente gli effetti batterici delle concentrazioni scelte. Figura 4A: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4B: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4C: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4D: Effetto della rifampicina su A. baumannii DSM-30008 crescita e metabolismo. (A) Termogrammi indicati come flusso di calore (W) rispetto al tempo (h) per il tipo selvaggio (WT) A. baumannii DSM-30008, non trattati ed esposti alla rifampicina. (B) Calore cumulativo (mJ) rispetto al tempo (h). (C) Tempo di picco (h) con barre di errore (deviazione standard). (D) Tasso metabolico (W) con barre di errore (deviazione standard). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. La più bassa concentrazione di prova selezionata dell’antibiotico del prodotto naturale (0,25 M) non ha effetti marginali o solo marginali sul termogramma di A. baumannii DSM-30008. Tuttavia, altre concentrazioni testate presentano qualche effetto sulla durata della fase di ritardo e influenzano la crescita fino alla fase stazionaria tardiva (Figura 5A). L’effetto più evidente è la significativa riduzione delle emissioni di calore nella fase stazionaria. I dati visualizzati nella figura 5B mostrano chiaramente che l’energia rilasciata è significativamente diminuita per tutte le concentrazioni effettive e anche la pendenza è diminuita. Questi effetti si traducono in una diminuzione del tempo al picco (Figura 5C) e, cosa più importante, si osserva una diminuzione significativa e chiaramente dipendente dalla dose nel tasso metabolico (Figura 5D). L’indagine sul nuovo prodotto naturale mixobacterial ha rivelato un effetto batteriostatico e battericida combinato. Figura 5A: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5B: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5C: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5D: Effetto di un nuovo prodotto naturale antibatterico su A. baumannii DSM-30008 crescita e metabolismo. (A) Termogrammi indicati come flusso di calore (W) rispetto al tempo (h) per il tipo selvaggio (WT) A. baumannii DSM-30008, non trattati ed esposti al prodotto naturale. (B) Calore cumulativo (mJ) rispetto al tempo (h). (C) Tempo di picco (h) con barre di errore (deviazione standard). (D) Tasso metabolico (W) con barre di errore (deviazione standard). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare 1: Selezione di un nuovo esperimento nell’interfaccia software. In un quadrato rosso viene raffigurato il passaggio per selezionare un nuovo esperimento. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 2: Denominazione di un nuovo esperimento nell’interfaccia software. In un quadrato rosso viene raffigurato il passaggio per nominare e confermare il nuovo esperimento. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 3: Avvio di un nuovo esperimento nell’interfaccia software. In un quadrato rosso viene raffigurato il passo per iniziare un nuovo esperimento. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 4: Ben selezione e reazione avviare nell’interfaccia software. Tutti i pozzetti di reazione sono selezionati (pozzi colorati in colore blu scuro, pulsante Seleziona tutto raffigurato in un quadrato rosso) e viene selezionato l’inizio della reazione (rappresentato in un quadrato rosso). Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 5: corretto caricamento del supporto della tazza. I pozzetti di riferimento sono selezionati (colore blu scuro, quadrato rosso) e i termogrammi vengono visualizzati in una finestra popup. Quando il carico viene eseguito correttamente, osserviamo un forte calo del segnale di emissione di calore rilevato che deve raggiungere una fase di altopiano e rimanere in questa fase per circa 2-3 min, poi il segnale ritorna al punto di partenza. Quando questo si osserva il carico del supporto della tazza è corretto. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 6: Fine dell’esperimento. In rosso, viene raffigurato il pulsante Interrompi nell’esperimento. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 7: Conferma della fine dell’esperimento. In rosso, viene illustrato il pulsante Sì per confermare la fine dell’esperimento in esecuzione. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 8: Salvataggio del file dell’esperimento. Viene visualizzata una finestra popup con le opzioni di salvataggio del file e in rosso viene raffigurato il pulsante Salva. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 9: Interfaccia software. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 10: Accesso agli esperimenti salvati. In rosso viene raffigurato il pulsante Apri esperimento per accedere agli esperimenti salvati. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 11: apertura del file dell’esperimento selezionato. In rosso viene raffigurato il pulsante Apri. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 12: visualizzazione pozzi predefinita. Tutti i ben sperimentali e i termogrammi corrispondenti sono visibili. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 13: Selezione dei pozzetti per l’analisi. In rosso viene raffigurato il pulsante Seleziona tutto. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 14: Definizione della linea di base. In rosso viene raffigurato il pulsante Definisci linea di base. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 15: Selezione del segnale di base. Viene selezionato un minimo di 30 min di segnale nella fase di ritardo (scatola rossa). Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 16: Salvataggio delle modifiche al file sperimentale. In rosso viene raffigurato il pulsante Salva. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 17: Applicazione di analisi Calorimetria basata sul Web. Vengono visualizzati l’interfaccia software online e il percorso di caricamento dei file. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 18: Caricamento del file sperimentale selezionato. In rosso viene raffigurato il pulsante Apri. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 19: Analisi dei termogrammi. I parametri metabolici calcolati per ogni pozzo sperimentale sono raffigurati in rosso. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 20: Adattare i dati sperimentali ai modelli di crescita teorica. I dati del flusso di calore sono adattati a un Gompertz o a un modello di crescita di Richard. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura. Figura supplementare 21: Esportazione delle misurazioni. In rosso vengono raffigurati i pulsanti Scarica misure e Salva. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.