פרופיל חילוף חומרים כדי לקבוע את ההשפעות Bactericidal או Bacteriostatic של מוצרים טבעיים חדשים באמצעות מיקרוקלורימטריה איזותרמית
Summary
ההברה של מצב הפעולה של אנטיביוטיקה חדשנית היא משימה מאתגרת בתהליך גילוי התרופה. מטרת השיטה המתוארת כאן היא היישום של מיקרוקלורימטריה isothermal באמצעות calScreener בפרופיל אנטיבקטריאלי כדי לספק תובנה נוספת על אינטראקציות סמים-חיידקים.
Abstract
בשל האיום העולמי של עמידות מיקרוביאלית עולה, אנטיביוטיקה רומן נחוצים בדחיפות. אנו חוקרים מוצרים טבעיים מ Myxobacteria כמקור חדשני של תרכובות חדשות כאלה. צוואר בקבוק אחד בתהליך הוא בדרך כלל ההברה של מצב הפעולה שלהם. לאחרונה הקמנו מיקרוקלורימטריה isothermal כחלק צינור פרופיל שגרתי. טכנולוגיה זו מאפשרת לחקור את ההשפעה של חשיפה לאנטיביוטיקה על התגובה המטבולית החיידקית הכוללת, כולל תהליכים המפוענחים מהיווצרות ביומסה. חשוב לציין, אפקטים bacteriostatic ו bactericidal ניתן להבחין בקלות ללא כל התערבות המשתמש במהלך המדידות. עם זאת, מיקרוקלורימטריה isothermal היא גישה חדשה למדי ויישום שיטה זו על מינים חיידקיים שונים בדרך כלל דורש הערכה מראש של תנאי מדידה מתאימים. ישנם כמה תרמוגרם התייחסות זמין של חיידקים מסוימים, מאוד להקל על פרשנות של תוצאות. ככל שבריכת נתוני ההתייחסות גדלה בהתמדה, אנו מצפים שלמתודולוגיה תהיה השפעה גוברת בעתיד ומצפים שהיא תאפשר ניתוחי טביעות אצבע מעמיקים המאפשרים בידול של שיעורי אנטיביוטיקה.
Introduction
מטרת שיטה זו היא להחיל מיקרוקלורימטריה isothermal (IMC) כמו תפוקה בינונית assay במצב של פעולה (MoA) פרופיל של תרכובות אנטיבקטריאליות חדשות. שיטה זו חושפת נתונים לגבי הפעילות של תרכובות על מינים חיידקיים ומספקת מידע על האופי bactericidal או bacteriostatic של המתחם עצמו.
עלייתה של עמידות מיקרוביאלית המתעוררים (AMR) היא בעיה גלובלית וזה מוביל טיפולים פחות יעילים של זיהומים נפוצים עם אנטיביוטיקהידועה 1. עם זאת, החיפוש אחר תרכובות ותרופות חדשות שיכולות להחליף או לעבוד בשילוב עם אנטיביוטיקה ידועה נמשכות וזה בנוי על גישות מגוונות. מוצרים טבעיים הם שחקן מפתח בקמפיינים הנוכחיים גילוי סמים ובמיוחד בגילוי תרופות נגדזיהומים 2. עם זאת, זיהוי מבני עופרת חדשים לפיתוח אנטיביוטיקה הוא תהליך ארוך ותובעני מבחינה כלכלית3. לכן, השלבים המוקדמים של הגילוי חשובים מאוד על מנת לסנן על הפיגומים המבטיחים ביותר כבר בשלב מוקדם. צעדים ראשוניים בגילוי תרופות מוצר טבעי כוללים השגת מבנה של מתחם, קביעת הפעילות במבחנה יחד עם MoA וזיהוי היעד. רוב התרכובות המוצלחות להיות זכאי לפיתוח נוסף צריך להציג ספקטרום חיובי של פעילות (כלומר, פעילות ספקטרום רחב במקרה של אנטיבקטריאליים) רומן MoA שבו AMR קיים מראש ניתן להתגבר. פיגומים מבטיחים מוקרנים בדרך כלל בהנאות משנית, הכוללים זמינות ביולוגית vivo, רעילות, וחילוף חומרים4. מלבד החששות הכספיים, גילוי תרופות מוצר טבעי עומד בפני אתגרים נוספים לגבי העלויות וקשיים טכניים הקשורים בידוד מורכב טיהור, אשר, בתורו, יכול לעשות את זה קשה להשיג כמויות מרובות מיליגרם או אפילו גרם בשלבים המוקדמים שלתהליך הגילוי 5,6. לכן, יש חשיבות עליונה במחקר המוצר הטבעי כדי להיות מסוגל לבצע ההקרנה העיקרית המדינה-of-the-art עם כמויות מורכבות מינימליות על מנת לקחת החלטה מושכלת על השקעות נוספות כדי להפוך מוצר טבעי חדשני נגיש לפיתוח פרה-קליני. עם השימוש IMC עבור פרופיל אנטיבקטריאלי, כמות המתחם הדרוש מופחת באופן משמעותי בהשוואה לשיטות סטנדרטיות. הטכניקה מספקת גם מידע מעמיק יותר לגבי האינטראקציה של תרופות חדשות עם הקהילה המיקרוביאלית7.
IMC היא שיטה מבוססת למדידת אנרגיה כוללת כתוצאה מכל התהליכים הביולוגיים, הפיזיים והביוכימיים והתגובות במערכת ביולוגית. שחרור אנרגיה חיידקית הוא פרופורציונלי לתגובות חילוף החומרים הכולל8. בתוך מערכת סגורה, כגון מיקרוקלורימטר בשימוש, ניתן למדוד את רמות החום בטווח microwatt כדי ללמוד את הקינטיות חילוף החומרים שלחיידקים 9,10,11,12. החום (אנרגיה) המשתחרר על ידי חיידקים מקושר לפונקציות תאיות כי בבסיס חילוף החומרים שלהם, כי הם לא בהכרח פרופורציונליים ביומסה התא.
בתחילה, הישימות של קלורימטריה isothermal עבור בדיקות מיקרוביולוגיות הוגבלה בשל התפוקה הנמוכה שלה ונפחי בדיקה גבוהים. עם זאת, microcalorimeter בשימוש הוא ייחודי כפי שהוא משלב את היתרונות של קלורימטריה איזותרמית עם תפוקה מוגברת ודרישות מורכבות נמוכות יותר, מה שהופך אותו לכלי בעל ערך עבוריישומי גילוי סמים 10. יתר על כן, המכשיר מספק יתרונות נוספים על פני שיטות חלופיות למדידת קינטיקה צמיחה חיידקית, כגון שיטת המערבולת הסטנדרטית, אשר מבוסס על מדידה של צפיפות אופטית ב 600 טנ”מ (OD<600). מדידת OD600 מבוססת על ההנחה כי צפיפות אופטית מוגברת שווה לצמיחה מיקרוביאלית, ובכך מזניחה את הנוכחות של תאים שאינם קיימא. שיטה זו גם זכתה לביקורת מכך שהיא אינה כוללת משתני מושבה קטנים ותאים Persister11. לעומת זאת, IMC מאפשר תצפית בזמן אמת של כל סוג של תאים קיימא. אם התאים רדומים, הם עדיין מפגינים פעילות מטבולית ולכן הם יכולים להתגלות על ידי IMC, בעוד תופעות כאלה אינן ניתנות לזיהוי על ידי שיטת המערבולתהסטנדרטית 11. יתרונות אחרים של IMC כוללים זמן בדיקה קצר יותר של רגישות מיקרוביאלית, מדידת אינטראקציות סמים בקהילה מורכבת ושיטות ניתוח סטנדרטיות מבלי להרוס אתהמדגם 7.
טכנולוגיית IMC יושמה במגוון רחב של מחקרים, החל ממיקרוביולוגיה ועד תרמוגנזהוביולוגיה של סרטן 13,,14,,15,,16,,17. היישומים המיקרוביאליים כוללים את הקביעה של ריכוזים מעכבים מינימליים (MIC) של תרכובות נגד זנים חיידקיים שונים. מספר מחקרים נעשו והוסכם כי נתוני מיקרופון מקלורימטריה isothermal עבור רוב המינים חיידקים ניתן להשיג מהר יותר והתוצאות דומות בהשוואה לשיטות אחרות (סטנדרטיות) לקביעת מיקרופון12,18,19. יישומים נוספים של IMC כוללים התבוננות באינטראקציה של תרופות ושילוב של טיפולים תרופתיים עם קהילות חיידקים מורכבים כגון biofilms11. מחקר המתמקד בפרופיל MoA הראה כי מיקרוקלורימטר יכול לזהות הבדל צפלוספורינים הדור הראשון והשני, בעוד אנטיביוטיקה שונה עם אותו MoA להפגין עקומת זרימת חום דומה בהשוואהזה לזה 18.
כאן, אנו מתארים את השימוש IMC עבור פרופיל MoA של מוצרים טבעיים חדשים באמצעות מכשיר מיקרוקלורימטריה isothermal החדש. השיטה משמשת כדי לקבוע ריכוזים אנטיביוטיים יעילים ולתאר מאפיינים של אנטיביוטיקה במונחים של מנגנוני bactericidal או bacteriostatic. השיטה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב בפרופיל MoA של תרכובות וזה עשוי להחליף או לפחות להשלים שיטות מיקרוביולוגיות סטנדרטיות. מחקרים עתידיים יכללו ניתוחי טביעות אצבע מעמיקים שיאפשרו בידול של מחלקות אנטיביוטיות בהתבסס על מנגנוני היעד.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרוקלורימטריה איזותרמית מודדת אנרגיה הנפלטת מדגימה לאורך זמן ושחרור אנרגיה זה הוא תוצאה של כל התהליכים הכימיים הביולוגיים, הפיזיים (הביולוגיים והביו-כימיים). זרימת החום נמדד ניתן לנצל כדי להעריך או לקבוע השפעות אנטיבקטריאליות של חומרים כפי שהוא מאפשר ניטור רציף בזמן אמת של פעילות מטבולית.
על מנת להשיג נתונים אמינים לניתוח, יש לקבוע יחידות נכון של מושבה (CFU) בנפרד עבור כל מין או זן המשמשים. במקרה ספירת CFU הוא נמוך מדי, זה מוביל שלב השהיה ממושכת כפי שלוקח זמן רב יותר עבור המערכת להגיע כמות קריטית של ביומסה לייצר מספיק חום כדי להתגלות. במקרה שספירת CFU גבוהה מדי, שלב ההשהיה יהיה קצר מאוד, וכמות החום המיוצר עלולה לגרום להעברת חום לתאי חיישנים סמוכים (הפניה ובבארות ניסיוניות) ולגרום לעיוותים של התרמוגרם. מספרים גבוהים של CFU גם יובילו לדלדול חמצן מהיר יותר ולעבור לתנאים אנאירוביים. יש לקחת בחשבון גם כי במהלך 30 הדקות הראשונות של הניסוי, כאשר המערכת משווה, איסוף נתונים אינו אפשרי וההקלטה בפועל של אפקטים מתעכבת. בנוסף, קביעת CFU שגויה מובילה לקביעת MIC כוזבת, ובסופו של דבר משפיעה על הניסוי ועל השינויים שנצפו25. נקודה קריטית נוספת היא הקביעה הנכונה של קו הבסיס. בדרך כלל, האות הבסיסי נבחר במהלך שלב ההשהיה כאשר אות זרימת החום הוא אפס ובאופן אידיאלי, טווח הזמן להגדרה בסיסית הוא >30 דקות. עם זאת, זה לא תמיד אפשרי כמו הזמן כי החיידקים דורשים להגיע למגבלת זיהוי אותות חום שונה בין זנים מינים. מינים או זנים מסוימים דורשים יותר מ-30 דקות כדי להגיע למגבלת זיהוי אותות החום בעוד זנים או מינים אחרים מגיעים אליהם ב-30 הדקות הראשונות. במקרה זה, ניתן לבחור את האות הבסיסי בסוף הניסוי כאשר כל אותות החום ירדו בחזרה לאפס ולהישאר יציבים. לחלופין, ניתן להשתמש בנספות מניסויים אחרים עם אותו זן חיידקי, אשר עם זאת אינו מומלץ.
המערכת מאפשרת גמישות מסוימת במונחים של עיצוב ואופטימיזציה של ניסויים ופתרון בעיות. כרכים בשימוש נמצאים בטווח של 100-300 μL בעת שימוש תוספות פלסטיק 100-600 μL בעת שימוש כוסות טיטניום ללא תוספות פלסטיק. נפח העבודה המומלץ על ידי היצרן הוא 120 μL. השימוש בכמויות שונות בהקמת סדרה ניסיונית חדשה, ותוך מציאת תנאים אופטימליים למדידות, משפיע בעיקר על שני פרמטרים. באמצעות אמצעי אחסון נמוכים יותר, ניתן להקטין את כמות תרכובת הבדיקה הנדרשת, דבר שחשוב במיוחד עבור תרכובות, הזמינות רק בכמויות קטנות. בנוסף, הנפח בשימוש משפיע ישירות על זמינות החמצן במהלך המדידה עם נפחים נמוכים יותר להגדיל את כמות החמצן הזמין הנדרש לצמיחה חיידקים. דלדול חמצן הוא אחד הגורמים העיקריים התורמים למשך הזמן המרבי האפשרי של הניסוי. חשוב לציין, ניתן להשתמש במדיה מוצקה, לא רק במדיה נוזלית. זה חשוב במיוחד עבור מיקרואורגניזמים בצמיחה איטית כמו צמיחה בממשק בין שלב מוצק וגז מאפשר גישה טובה יותר חמצן9.
IMC הוא כלי אנליטי שימושי לגילוי תהליכים לא ידועים עם יישומים בפיזיקה, כימיה וביולוגיה. השיטה מודדת את חילופי החום בתוך מערכת סגורה וניתוח של חילופי החום המתוקליטים מספק מידע נוסף שלא תמיד ניתן להשיג בשיטות סטנדרטיות. במחקר מיקרוביולוגיה ואנטיביוטיקה, אחד היתרונות הגדולים ביותר של IMC היא היכולת שלה להבחין בין תאים חיים, מתים ו persister או רדום, אשר אינו אפשרי באמצעות שיטות טורביותסטנדרטיות 11. בנוסף, IMC הוא רגיש מאוד והוא יכול לזהות פליטת חום מ כמה שיותר 104-105 תאים9. יתרון נוסף הוא שההתקנה הניסיונית מהירה וקלה, והיא מאפשרת מעקב רציף בזמן אמת עם מינימום עד ללא הפרעה למשתמש. יתר על כן, IMC הוא לא הרסני, המאפשר ניתוח נוסף של דגימות. ניתוח נתונים מאפשר פענוח של היווצרות ביומסה עד שלב אקספוננציאלי מאוחר או נייח מוקדם ופעילות מטבולית בשלב נייח.
מלבד תכונות היישום הרומן והמרגש שהוזכרו לעיל, יש גם חסרונות לשיטה זו. המגבלה העיקרית היא שמכשירי IMC מודדים את החום הכולל המיוצר ומשוחרר בתוך מערכת ספציפית, הכוללת גם אותות לא ספציפיים. זה מדגיש את החשיבות של תכנון ניסיוני עם פקדים מתאימים כדי להיות מסוגל להעריך את שינויי אות החום הנמדדים על ידיהקלטת זרימת חום 9,20.
בידיים שלנו, IMC הוא כלי חשוב ללמוד השפעות אנטיבקטריאליות של מוצרים טבעיים חדשים ולקבוע טווחי ריכוז יעילים. מלבד הבדיל בין השפעות bacteriostatic ו bactericidal, זה יכול לשמש בעתיד כחלק מחקרי זיהוי היעד ונחישות MoA. זה יכול להיעשות על ידי השוואת תרמוגרם של מחלקות אנטיביוטיקה שונות לתרמוגרם של תרכובות פעילות חדשות כפי שמוצג כאן. עם זאת, עדיין צריך לחקור אם פרמטרים מסוימים הניתנים לכימות שניתן לחלץ מהנתונים הנמדדים מספיקים להשוואות כאלה או אם יהיה צורך לעבוד על אלגוריתמים המעניקים טביעות אצבעות המבוססות על תרמוגרם מלא. יישום אפשרי נוסף בתחום המחקר האנטיביוטיקה הוא השוואה של wildtype שיבוטים עמידים, יחד עם רצף הגנום כולו, אשר יכול לעזור בהדרת מצב ההתנגדות (MoR) של אנטיבקטריאליים חדשים. בשל האופי הסטטי של השיטה, חקירת היעילות של סוכנים חדשים על היווצרות biofilm או על biofilms כבר הוקמה יכול להוביל להבנה טובה יותר של התהליך הביולוגי ואת ההשפעה של סוכנים נבחרים על חיידקים בשלבים שונים של רדום. IMC רשומות אנרגיה כוללת שוחרר בצורה של חום מה שהופך אותו שיטה מתאימה לחקור גם השפעות תת מעכבות של חומרים פעילים שעשויים להיות יחד עם תעתיק. שיטה זו יכולה לשמש גם בהגדרות קליניות כדי לזהות זיהום של דגימות או לקביעת אנטיביוגרמות עוזר להחליט במהירות על טיפול מוגדר שלהחולים 11.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לצוות של Symcel על דיונים פוריים ואנחנו רוצים להכיר בתמיכה הגדולה של גאנה אוליניק ווילהלם פולנדר. ברצוננו גם להודות דניאל Kohnhäuser על מתן המוצר הטבעי סטפני שמידט עבור תמיכה טכנית מיומנת.
Materials
| Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
| calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
| calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
| calView software | Symcel | collection and analysis software | |
| calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
| CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
| Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
| Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
| Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
| Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
| Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
| Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
| Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
| Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
| Pipette 100 – 1000 µL | Brand | 705880 | |
| Pipette 2 – 20 µL | Brand | 705872 | |
| Pipette 20 – 200 µL | Brand | 705878 | |
| Pipette tips 100 – 1000 L | Brand | 732032 | |
| Pipette tips 2 – 200 µL | Brand | 732028 | |
| Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
| Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
| Sterile filters | Minisart | 16534———-K | 0.2 µm pore size sterile filters |
| Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
| Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
| Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
| Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
| Tweezers | Symcel | 1900602 |
References
- Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO) Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance (2018)
- Herrmann, J., Abou Fayad, A., Müller, R. Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities. Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).
- Cassar, S., et al. Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Bhusnure, O. G., et al. Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool. Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).
- Kraus, J., Tobin, G., Development, M., Kulka, Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products. Using Old Solutions to New Problems – Natural Drug Discovery in the 21st Century. , 4-36 (2013).
- Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. Fishing for Nature’s Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).
- Antimicrobial Development. Symcel Available from: https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development (2019)
- Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions. Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).
- Braissant, O., Wirz, D., Göpfert, B., Daniels, A. U. Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities. FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).
- Braissant, O., et al. Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay. Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).
- Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment. Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).
- Tellapragda, C., et al. Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli – A multicenter study. Clinical Microbiology and Infection. , (2020).
- Abdillahi, S., et al. Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity. The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).
- Astasov-Frauenhoffer, M., et al. Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms. PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).
- Gros, S., et al. Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).
- Kriszt, R., et al. Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Wadsö, I., et al. A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues. Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).
- von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. Isothermal micro calorimetry – a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus. BMC Microbiology. 9 (106), (2009).
- Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species. Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).
- Wadsö, I. Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).
- LeBel, M. Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions. Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).
- Chopra, I., Roberts, M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).
- Allison, J. L., et al. Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).
- Wehrli, W. Rifampin: mechanisms of action and resistance. Reviews of Infectious Diseases. 5, 407-411 (1983).
- Hancock, R. E. W., et al. Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).
