Adenovirüs Üretimi İçin Verimli Bir Yöntem

Güvenlik Notu: Genel olarak, adenovirüsler biyogüvenlik seviyesi 2 organizmalar olarak sınıflandırılır ve bu nedenle, tüm manipülasyonlar eğitimli bir kişi tarafından, biyolojik tehlike koruyucu ekipman (eldivenler, biyolojik aerosoller için yüz maskesi, laboratuvar önlüğü vb.) giyerek sınıf II biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Adenovirüs ile kontamine olan tüm katı malzemeler 30 dakika boyunca% 10 çamaşır suyu çözeltisi ile dezenfekte edilmeli ve 121 ° C ve 1 bar’da 30 dakika boyunca otomatik olarak kapatılmalıdır. Eklenen gene bağlı olarak, oluşturulan adenovirüs tehlikeli potansiyele sahip olabilir ve diğer biyogüvenlik seviyelerinde sınıflandırılabilir. 1. Deneysel hazırlık Adenoviral manipülasyonlar için ayrı bir hücre kültürü başlığı ve her adenovirüs tipi için ayrı bir inkübatör kullanın. Viral paketleme ve amplifikasyon için filtre kapaklı T şişeleri kullanın; havalandırmalı Petri plakalarında mümkün olduğunca transdüksiyon deneylerinden kaçının. Her kullanımdan sonra hücre kültürü başlığını boşaltın ve 15 dakika boyunca UV’ye maruz bırakın. Pipet yardımını, pipetleri ve diğer mutfak gereçlerini periyodik olarak otoklav edin. Mümkünse, ayrı bir hücre kültürü laboratuvarında/davlumbazında kültür, adenoviral ambalaj için hücreler (AD293 hücreleri) ve transdüksiyon deneylerinde kullanılacak hücreler. Aynı dönemde güçlendirilmiş farklı adenovirüs partileri PCR ile çapraz kontaminasyon açısından kontrol edilmelidir. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın. SOB (Super Optimal Broth) ortamı hazırlayın: 20 g tripto, 5 g maya özü, 0,5 g NaCl (10 mM son konsantrasyon), 2,5 mL 1 M KCl (2,5 mM son konsantrasyon), amd H2O ila 1 L. 121 °C’de otoklavlamadan sonra, aşağıdaki steril çözeltileri ekleyin: 5 mL 1 M MgCl2 ve 5 mL 1 M MgSO4. SOC (Catabolite baskılı Süper Optimal et suyu) ortamını hazırlayın: 1 L steril SOB’da aşağıdaki steril çözeltileri ekleyin: 20 mL 1 M glikoz, 5 mL 1 M MgCl2 ve 5 mL 1 M MgSO4. Yağış çözeltisi hazırlayın: 60 mL H 2 O’da29,5g potasyum asetat çözün, 11,5 mL asetik asit ekleyin ve H2O ila 100 mL. Resüspensiyon tamponunu hazırlayın: 95 mL% 20 glikoz, 5 mL 1 M Tris-Cl pH 8, 4 mL 0.5 M EDTA pH 8 ve200mL’ye H 2 O ekleyin. Lizis çözeltisi hazırlayın: 4,8 mL 8,3 M NaOH, 10 mL% 20 SDS ve H2O ila 200 mL. 2. BJ5183 bakterilerinde pAdTrack-GFP viral vektörün pAdEasy-1 plazmid ile rekombinasyonu pAdTrack-GFP’nin doğrusallaştırılması ve doğrusallaştırılmış plazmidlerin saflaştırılması. Buz üzerinde aşağıdaki sindirim karışımını hazırlayın:10 μg pAdTrack-GFP5 μL 10x renksiz tampon2 μL Pme IH 2O’dan 50 μL’lik son hacme kadar. Bir su banyosunda 3 saat boyunca 37 ° C’de kuluçkaya yatır. 65 °C’de 20 dakika inaktive edin. Pme I ile pAdTrack-GFP’nin sindiriminin verimliliğini kontrol edin: %0,8 agarose jel üzerinde 1 μg sindirilmemiş plazmid ile paralel olarak sindirilmiş plazmid 1 μg çalıştırın. DNA’nın izolasyonu ve saflaştırılmasıNOT: 1-6. adımların duman kaputunda yapılması gerekir. Sindirim karışımının üzerine eşit miktarda fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) ekleyin ve karışım homojen olana kadar tüpü ters çevirin. 16.200 x g’da3 dakika santrifüj ve ardından üst sulu fazı bir toplama tüpüne aktarın. Alt organik faz ve girdap üzerine eşit miktarda fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) ekleyin. 16.200 x g’da3 dakika santrifüj ve ardından üst fazı aynı toplama tüpüne aktarın. Toplama tüpünde ve girdapta hasat edilen sulu fazın üzerine eşit miktarda kloroform ekleyin. 16.200 x g’da3 dakika santrifüj ve ardından üst sulu fazı yeni bir toplama tüpüne aktarın. 1/10 hacimli 3 M sodyum asetat ve 2 cilt soğuk % 100 etanol ve girdap ekleyin. -70 °C’de 1 saat veya -20 °C’de gece boyunca kuluçkaya yatırın. Numuneyi buz üzerinde çözün ve 16.200 x g ve 4 °C’de 10 dakika santrifüj edin. Süpernatant çıkarın ve% 75 etanol 750 μL ekleyin. 16.200 x g ve 4 °C’de 3 dakika santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Tüm süpernatant kaldırmak ve pelet kaput kurulamak için kısa bir süre tüp döndürün. DNA peletini uzun süre kurutmayın, çünkü çözünmesi zordur. Peletin 15 μL H2O’da çözün. Bir spektrofotometre (örneğin, Nanodrop) kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. pAdTrack-GFP ile AdEasier-1 bakterilerinin dönüşümüNOT: Bu adımda, pAdTrack-GFP’nin pAdEasy-1 plazmid ile yeniden birleşmesi gerçekleşir. Üreticilerin talimatlarını izleyerek ticari bir dönüşüm kiti kullanarak AdEasier-1 (BJ5183 içeren pAdEasy-1, Addgene #16399) kimyasal yetkin bakterileri hazırlayın. 100 μL yetkin bakterinin aliquotlarını -80 °C’de tutun. Buz üzerinde yetkin AdEasier-1 bakterilerinin bir aliquot çözün ve 1 μg saflaştırılmış Pme I – sindirilmiş pAdTrack-GFP ekleyin. Tüpü sallayarak hafifçe karıştırın (karışımı pipetle etmeyin). Buzda 10 dakika kuluçkaya yaslanın. 900 μL SOC ortamı ekleyin ve 37 °C’de 1 saat boyunca sallanarak kuluçkaya yatırın. 600 x g’da5 dakika boyunca mikro yakıt. 900 μL’lik süpernatantı çıkarın, pelet ve süpernatantı karıştırın ve LB-agar plakalarındaki dönüştürülmüş bakterileri kanamycin ile tohumlayın. 37 °C’de ~16 saat kuluçkaya yatır (18 saati aşmayın). Pcr ile olası pozitif klonların seçimi Kürdanları ikiye bölün ve yarı kürdanları otoklavlayarak sterilize edin. Steril yarı kürdan kullanarak küçük ve yarı saydam kolonileri alın. Kısaca, yarım kürdanı 10 μL suda (pcr tüpünde) bakterilerle döndürün ve ardından yarım kürdanı kanamycinli 100 μL SOC ortamı içeren 1,5 mL Eppendorf tüpüne koyun. Klonları “negatif” ve “pozitif” PCR ile test ederken, 37 ° C’de 4-6 saat kuluçkaya yatırın. Bakteri örneğini elde etmek için 10 μL su içeren PCR tüplerini 95 °C’de 5 dakika boyunca bakterilerle kuluçkaya yatırın ve “negatif” ve “pozitif” PCR’ye paralel olarak çalıştırın. “Negatif” PCR – pAdTrack-GFP bütünlüğünü test etmek için: Buzdaki negatif PCR için aşağıdaki PCR karışımını hazırlayın.Bakteri örneğinin 5 μL’si0.1 μL Astar İleri (4631 F: 5′-CAGTAGTCGGTGCTCGTCCAG)0.1 μL astar Ters (5616 R: 5′-TATGGGGGCTGTAATGTTGTCTC)0,1 μL dNTP 10 mM3 μL 5x Tampon1,5 μL MgCl2 25mM0.1 μL GoTaq PolimerazH2O ila 15 μL’lik son hacimNOT: DNA şablonlarının pAdTrack-GFP vektörü olduğu pozitif kontrol dahil edilmelidir. “Pozitif” PCR – ilgi geninin varlığını test etmek için. Eklenen gen için belirli astarlar kullanın ve karışımı önceki adımda olduğu gibi hazırlayın. GFP için kullanılan astarlar şunlardı:F: 5′-CAAGGACGACGGCAACTACAR: 5′-ATGGGGGTGTTCTGCTGGTA “Negatif” ve “pozitif” PCR’ye paralel olarak çalıştırın. PCR Programı: 5 dk, 95 °C; Aşağıdaki adımların 40 döngüsü: 30 sn, 95 °C; 30 sn, 68 °C; 1 dk, 72 °C; son uzama: 10 dk, 72 °C.NOT: İlgi genini amplifikasyon için tavlama sıcaklığını uyarlayın. PCR ürünlerini% 1 agarose jel üzerinde değerlendirin ve klonların seçimini yapın. “Negatif PCR” için PCR ürünü vermeyen klonları ve “pozitif PCR”den sonra belirli BIR PCR ürününü daha fazla işlemeyi düşünün. Seçilen rekombinant klonların bakteri kültürlerini büyütün Kanamycin ile 4 mL SOC ortamında varsayılan pozitif klonların kültürlerini seyreltin (adım 2.4.3.) ve bir gecede 37 ° C’de sallanarak kuluçkaya bırakın. AdEasier-1 bakterilerinden plazmid DNA izolasyonu (Alkali liziz kullanarak miniprep) Mikrosantrifüj tüplerinde 1,5 mL bakteri kültürünü aktarın, 16.200 x g’da1 dakika santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Aynı tüpte başka bir 1,5 mL bakteri kültürünü aktarın, santrifüjü tekrarlamayı tekrarlayın ve süpernatantı çıkarın. 200 μL resüspensiyon tamponu ekleyin (50 mM glikoz, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH 8). 200 μL lizis çözeltisi ekleyin (0,2 N NaOH, % 1 SDS), tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. 200 μL çökeltme çözeltisi (60 mL 5 M potasyum asetat, 11,5 mL buzul asetik asit ekleyin, 100 mL’ye kadar H2O ekleyin) ve tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. 16.200 x g’da3 dakika santrifüj. Süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, 500 μL izopropanol ekleyin, karıştırın ve buzda 20 dakika kuluçkaya yatırın. 16.200 x g’da 15 dakika santrifüj ve 500 μL% 75 etanol ekleyin. 16.200 x g’da 10 dakika santrifüj ve süpernatantı çıkarın. 16.200 x g’da3 dakika santrifüj, süpernatantı çıkarın ve 15 μL H2O ekleyin. Yeniden birleştirilmiş plazmidlerin amplifikasyonu, izolasyonu ve yeniden test edilmesi AdEasier-1 hücrelerinden izole edilen DNA ile DH5α bakterilerinin dönüşümü. Üreticilerin talimatlarına uyarak ticari dönüşüm kitini kullanarak DH5α yetkin bakterileri hazırlayın. Buz üzerinde 100 μL DH5α yetkin bakterisini çözün, rekombinant DNA’yı ekleyin ve buzda 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra bakterileri kanamycin ile LB-agar plakalarına tohumlayın. Gece boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatır. Birkaç koloni toplar ve her birini kanamycin ile 2 mL LB ortamında, bir gecede 37 °C’de, sallanarak büyütür. DNA’yı izole edin (alkali lizis kullanarak Miniprep) ve elde edilen DNA’yı 25 μL H2O’da yeniden diriltir. Pozitif klonları enzymatic sindirim ile onaylayın. Buz üzerinde aşağıdaki karışımı hazırlayın:5 μL rekombinant DNA1.5 μL 10x renksiz Tampon0,5 μL Hind III veya Pst IH2O ila 15 μL’lik son hacim 37 °C’de 30 dakika kuluçkaya yatır.NOT: Kontrol olarak, pAdTrack-GFP ve pAdEasy-1 plazmidlerini de sindirin. Her numuneye RNase A ile 3 μL Sx6 yükleme tamponu ekleyin (miniprep arabelleklerinde RNase A yoksa). Sindirilen DNA parçalarını %1 agarose jel elektroforezi üzerinde çalıştırın.NOT: Pozitif bir klonun sindirim deseni, sindirilen pAdEasy plazmid parçalarının çoğunu içerir ve pAdTrack vektörü ile pAdEasy rekombinasyonunu ortaya çıkarır. İlgi geni klonlama için kullanılan kısıtlama enzimleri ile sindirim ile kanıtlanmalıdır. Adenovirüs ambalajı için plazmid DNA (transfeksiyon sınıfı) hazırlanması. Plazmid DNA’yı izole etmek için pozitif bir klondan 200 mL bakteri kültürü yetiştirin. Plazmid DNA’yı, üreticinin talimatlarını izleyerek plazmid DNA Midiprep (örneğin, Qiagen Plasmid Midi Kit) için ticari bir kit kullanarak izole edin. 3. Adenoviral parçacıkların paketlenmesi 1. Gün. AD293 hücrelerinin tohumlarını AD293 hücrelerini PBS ile yıkayın ve 37 °C’de 2-5 dakika boyunca% 0.125 Trypsin ile kuluçkaya yatırın. Hücreleri serumla soğuk ortamda toplayın. 4 °C’de 400 x g’da 5 dakika santrifüj. Hücreleri serumla orta hızda yeniden depola ve hücreleri ~2 x 106/T25 şişe yoğunluğunda tohumla. Tercihen, filtreli bir şişe kullanın. 1. Gün. Pac I ile rekombinant DNA’yı sindirin Aşağıdaki karışımı hazırlayın:6 μL rekombinant DNA (1 μg/μL)2 μL Pac I2,5 μL 10x renksiz TamponH2O ila 25 μL’lik son hacim 37 °C’de 3 saat (veya geceleme) kuluçkaya yatırın ve ardından enzimi 65 °C’de 20 dakika boyunca inaktive edin. Etanol ile DNA çökeltme: 2,5 μL (1/10 v/v) 3 M sodyum asetat ve 2-3 hacim% 100 etanol ekleyin. -70 °C’de 30 dakika veya -20 °C’de bir gecede kuluçka. 4 °C’de 30 dakika boyunca 16.200 x g’da santrifüj ve peletin steril suya yeniden harcanır. 2. Gün: AD293 hücrelerinin K2 reaktifi kullanılarak transfeksiyon Transfeksiyondan iki saat önce, hücrelerin üzerine 40 μL K2 Çarpanı ekleyin. A ve B çözümleri hazırlayın:Çözüm A: Opti-MEM’in 260 μL’sinde 6 μg Pac l-lineerize DNA ekleyin.Çözüm B: Opti-MEM’in 248,4 μL’sinde 21,6 μL K2 Reaktif ekleyin. A çözeltisi B üzerine çözelti ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Hücrelere damla yönünde A ve B karışımı ekleyin. 3-11. Gün: Floresan mikroskopi ile GFP ekspresyonını izleyinNOT: Floresan mikroskopide hücreler yeşil görünmeli ve yavaş yavaş ayrılmalıdır. 11. Gün: F1 adenoviral parçacıklarını hasat Müstakil hücreleri ve ortamı 50 mL’lik bir tüpte toplayın, yapışan hücreleri kazıyın ve aynı tüpe ekleyin. 400 x g’da 5 dakika santrifüj, süpernatantı yeni bir tüpte toplayın ve hücre peletini 0,5 mL PBS’de yeniden biriktirin. Hücre kesintisi Hücre süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Üç dondurma/çözme döngüsü gerçekleştirin (sıvı nitrojende dondurun veya maksimum 7 dakika boyunca 37 °C’de -80 °C /thaw’da dondurun). Kırık hücreleri üç kez 23 G şırınga iğneden geçirin. Hücre kalıntılarını 12 dakika boyunca 9.600 x g’da santrifüjleme ile çıkarın. Süpernatant toplanan ortam ile 50 mL tüpe aktarın. 4. Adenovirüs’ün amplifikasyonu NOT: AD293 hücreleri gerekli izdihama ulaşmadıysa enfeksiyon için kullanılacak adenoviral stokların (virüs üreten hücrelerden elde edilen lisat) aliquotları -80 °C’de saklanabilir. F2 adenoviral parçacıklarını hazırlayın. AD293 hücrelerini bir T75 şişesinde (5 x 106 hücre/şişe) tohumla. F1 adenoviral parçacıklarını kullanarak ~ birleştirilmiş AD293 hücrelerini enfekte edin: T75 şişesinde yetişen hücrelerin üzerine hücre homojenatı ve T25 şişesinden ortamı ekleyin. Floresan mikroskopi ile GFP ekspresyonını izleyin. Transdüklenmiş AD293’ün ~’ı ayrıldığında virüs üreten hücreleri hasat etmek (~ transdüksiyondan sonraki5. gün). Hücre kültürünü 4 °C’de orta tutun. 1 mL PBS’deki hücreleri (F1’dekilerle benzer şekilde) bozun. F3 adenoviral parçacıklarını hazırlayın. T175 şişesinde tohumlanan ~ birleştirilmiş AD293 hücrelerini F2 adenoviral parçacıklarla ve F2 adenoviral parçacıklardan hücre kültürü ortamını enfekte edin. Hücreleri hasat (~5 gün sonra transdüksiyon). 2 mL PBS’deki hücreleri (F1’dekilerle benzer şekilde) bozun. F4 adenoviral parçacıklarını hazırlayın. F3 adenoviral parçacıklar ve hücre kültürü ortamı ile ~ birleştirilmiş AD293 hücreleri içeren 5 T175 şişesini enfekte edin. Hücreleri hasat (~5 gün sonra transdüksiyon). 3 mL PBS’de hücreleri (F1’dekilerle benzer şekilde) bozun. F5 adenoviral parçacıklarını hazırlayın. F4 adenoviral stok ve hücre kültürü ortamı ile ~ birleştirilmiş AD293 hücreleri içeren 25 T175 şişesini enfekte edin. 5. Adenovirüs’ün hücre lisatından ve kültür ortamından arındırılması Virüs üreten hücrelerin ve kültür ortamının toplanması. F5’in AD293 hücrelerini transdüksiyondan 5 gün sonra hasat edin. Ortamı, adenoviral parçacıkların çökelttiri için steril bir şişeye saklayın.NOT: Adenovirüs saflaşına kadar ortamı buzdolabında tutun. Hücreleri 400 x g’da, 5 dakika boyunca, 4 oC’de santrifüj edin. Son peletin 5 mL’si 10 mM Tris HCl, pH 8’i 2 mM MgCl2ile yeniden biriktirin. 1,5 mL tüplerde süspansiyon aliquot. Hücreleri bozun (F1 için olanlarla benzer şekilde): üç donma/çözülme döngüsü.NOT: Ultrasantrifüjleme hemen yapılamıyorsa, numuneleri -80 °C’de tutun. Hücre süspansiyonu üç kez 23G şırınga iğneden geçirin. Homojenatı 9 600 x g’da 12 dakika santrifüj edin. CsCl gradyan ultrasantrifüjleme ile süpernatantı adenovirüs saflaştırması için sakla. Kültür ortamında salınan adenovirüs yağışları. Oda sıcaklığında kaydedilmiş hücre kültürü ortamına sahip şişeyi getirin. Her 500 mL hücre kültürü ortamına 121 g amonyum sülfat ekleyin (çözeltinin doygunluğu% 40 – 42 arasında olmalıdır). Amonyum sülfat tamamen çözünene kadar dikkatlice karıştırın. Oda sıcaklığında en az 2,5 saat kuluçkaya yatırın. Santrifüj 1600 x g, 15 dakika, 22 oC ve pelet sakla. Peletin 4 mL’si 10mM Tris HCl pH 8’de 2mM MgCl2ile yeniden biriktirin; bu süspansiyon CsCl gradyan ultracentrifugation ile derhal arındırılmalıdır.NOT: Arıtma adımı daha sonra gerçekleştirilemezse, yeniden 10mM Tris HCl, 2mM MgCl 2 ile pH 8’e karşı yeniden uyarılmış peleteri bir gecede dialyzeedin. Ultrasantrifüjleme ile adenovirüs saflaştırması. SW41Ti rotor için polipropilen tüplerde süreksiz bir CsCl gradyani hazırlayın. Tüpün altına 3 mL 765 mg/mL CsCl (yüksek yoğunluk: 1,4 g/L) ekleyin. İlk CsCl katmanının üzerine yavaşça 3 mL 288,5 mg/mL CsCl (düşük yoğunluk: 1,2 g/L) ekleyin. Hücrelerden salınan veya hücre kültürü ortamından (daha önce açıklandığı gibi) gradyanın üzerine çöken 3 – 4 mL adenoviral parçacık süspansiyonunun hafifçe yer paylaşımı. Tüpleri mineral yağ ile doldurun ve tüpleri soğuk SW41Ti kovalarına koyun. Tüpleri aşındırın. Doldurulmuş polipropilen tüplerin rotora simetrik olarak yüklendiğinden emin olun. Rotor’u ultracentrifuge’a koyun. 210.000 x g ve 4 °C’de santrifüj, 18 saat boyunca fren yok. Bantları almak için ultracentrifuge tüplerini arkasında siyah bir kağıt olan bir standa yerleştirin. Net üst fazı, hücre kalıntılarını ve üst bandı ağartma çözeltisi ile bir atık kabına atın. Tam adenovirüs (~700 μL – 1 mL) içeren en düşük bandı steril 1,5 mL tüpte hasat edin ve buzda tutun. Diyaliz tamponunda diyaliz kasetini önceden ıslatma (10 mM Tris-Cl tampon pH 8, 2 mM MgCl2). Saflaştırılmış adenovirüsü 2 mL şırınna kullanarak diyaliz kasetine enjekte edin. Dialyze bir gecede 10 mM Tris-Cl tampon pH 8, 2 mM MgCl2 ‘ye karşı (diyaliz tamponunu 3 – 4 kez değiştirin). Adenoviral stoğu 10 – 100 μL’lik aliquots diyaliz kasetinden hasat edin. Viral aliquotlara %4 son konsantrasyona sakkaroz ekleyin (kriyoproteksiyon için). Aliquots’u -80 °C’de saklayın. 6. Adenovirüs titrasyonu 1. Gün: Hücreleri kaplama AD293 hücrelerini, Şekil 2’de gösterildiği gibi, 1 mL tam büyüme ortamında kuyu başına2,5 × 10 5 hücre (12 kuyu kültür plakasında) yoğunluğunda tohumlayın. Doğru titer tayini için hücrelerin her kuyuya eşit şekilde yayıldığını sağlayın. Şekil 2: Titrasyon plakası tasarımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 2. Gün: Hücrelerin transdüksiyon Hücreleri trypsin ile bir kuyudan ayırın ve sayın. Viral titreyi hesaplamak için kullanılacağından bu sayıya dikkat edin. Viral stokun seri seyreltmelerini (1/104;1/10 5; 1/106;1/10 7)1 mL tam büyüme ortamında aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 1/103: virüs stoğunun seyreltilmesi – 1998 μL tam ortasına 2 μL viral stok ekleyin. 1/104: 120 μL ila 1080 μL tam orta (A) seyrelterek 1/103’ün 1:10 seyreltilmesini yapın. 1/105: 120 μL A ila 1080 μL tam orta (B) seyrelterek B’nin 1:10 seyreltilmesini yapın. 1/106: 120 μL B ila 1080 μL tam orta (C) seyrelterek 1:10 C seyreltme yapın. 1/107: 120 μL C’yi 1080 μL tam orta (D) seyrelterek 1:10 D seyreltme yapın.NOT: Deneyi üç taraflı olarak gerçekleştirmek için her seyreltmeden (A, B, C, D) 3 tüp hazırlayın. Hücre kültürü ortamını kuyulardan çıkarın ve Şekil 2’degösterildiği gibi virüsün hazırlanan seyreltmelerini ekleyin. 3. Gün: GFP ifadesini izleme Floresan mikroskobu kullanarak kuyularda yeşil hücrelerin varlığını kontrol edin. 4. Gün: GFP pozitif hücrelerin akış sitometri analizi On iki 1,5 mL tüp hazırlayın ve etiketle. Hücre kültürü ortamını (müstakil hücrelerle birlikte) 1,5 mL tüplerde toplayın ve buzda tutun. Her kuyuya 200 μL tripsin ekleyin. Co 2 inkübatöründe plakayı 37 °C’de 2 -3 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri hücre kültürü ortamı ile aynı Eppendorf tüplerinde hasat edin. Tüpleri buzda tut. Hücreleri 400 x g’da, 5 dakika boyunca, 4 °C’de pelet. Üstnatant kaldırmak; Tüpleri buzda tut. Peleti 250 μL PBS + % 2 FBS’de yeniden diriltin; Tüpleri buzda tut. Hücre süspansiyonu akış sitometri tüplerine veya plakasına aktarın. Numuneleri, GFP ifade hücrelerinin floresanını kaydeden bir akış sitometresinde çalıştırın.Titer hesaplaması: Aşağıdaki formül kullanılarak viral titerin hesaplanması için ana popülasyondan% 5 – 20 GFP pozitif hücreli örnekler dikkate alınmalıdır:Titer (TU/mL) = D x F/100 x C/VD = seyreltme faktörüF = pozitif hücrelerin yüzdesi / 100C = hücre sayısı / kuyuV = viral inokülum hacmi 7. Hedef hücrelerin adenoviral transdüksiyonu ve indüklenen protein ekspresyonunun testine tabi ted 1. Gün: Hücrelerin tohumlama Kuyularda eşit olarak yayılmalarını sağlayan hedef hücreleri tohumla. 2. Gün: Hücrelerin transdüksiyon Hedef hücreleri bir kuyudan ayırın ve sayın. Hücreleri hücre başına istenen sayıda enfeksiyöz parçacıkla transdüze etmek için gereken uygun adenoviral süspansiyon hacmini hesaplayın. Hedef hücrelere ilgili miktarda viral süspansiyon ekleyin. 3. Gün: Viral süspansiyonun kaldırılması ve GFP ifadesinin kontrol edilmesi Adenoviral parçacıklar içeren hücre kültürü ortamını taze ortamla değiştirin. Floresan mikroskopta GFP ifadesini kontrol edin.