アデノウイルス産生のための効率的な方法

安全に関する注意事項: 一般に、アデノウイルスはバイオセーフティレベル2の生物に分類されるため、バイオハザード保護具(手袋、バイオエアロゾル用フェイスマスク、ラボコートなど)を着用して、訓練を受けた人がクラスIIバイオセーフティキャビネットですべての操作を行う必要があります。アデノウイルスに汚染されたすべての固体材料は、30分間10%の漂白剤溶液で消毒し、121°Cおよび1バールで30分間オートクレーブする必要があります。挿入された遺伝子に応じて、作成されたアデノウイルスは危険な可能性を有し、他のバイオセーフティレベルで分類される可能性がある。 1. 実験準備 アデノウイルス操作には別個の細胞培養フードを使用し、アデノウイルスタイプごとに別個のインキュベーターを使用する。ウイルスの包装と増幅のためのフィルターキャップとTフラスコを使用してください。通気されたペトリプレートでの可能な限り多くのトランスダクション実験を避けてください。 使用後に細胞培養フードを空にし、15分間UVに曝します。 オートクレーブは定期的にピペットの援助、ピペット、および他の道具を。可能であれば、別の細胞培養ラボ/フード内で、アデノウイルス包装用細胞(AD293細胞)および細胞をトランスダクション実験に用いる。同じ期間に増幅された異なるアデノウイルスのバッチは、PCRによる交差汚染をチェックする必要があります。 次のソリューションを準備します。 SOB(超最適ブロス)培地を調製:トリプトン20g、酵母エキス5g、NaCl(10mM最終濃度)の0.5g、1MKCl(2.5mM最終濃度)の2.5mL、アムドH2O〜1L。121°Cでオートクレーブした後、次の無菌溶液を追加します:5 mLの1 M MgCl2と5 mLの1 M MgSO4. SOC(カタボライト抑制による超最適なスープ)培地を準備する:1 L滅菌SOBでは、1Mグルコースの20mL、1M MgCl2の5mL、 および1M MgSO4の5 mLの無菌溶液を追加する。 沈殿液を調製する:酢酸カリウム29.5gをH2Oの60mLに溶解し、酢酸11.5mL、及びH2Oを100mLに加える。 再懸濁液バッファーを準備する:95 mLの20%グルコース、5 mLの1 MトリスCl pH 8、0.5 M EDTA pH 8の4 mL、およびH2Oを200 mLに加える。 溶解液を調製:8.3 M NaOHの4.8 mL、20%SDSの10 mL、およびH2O〜200 mL。 2. BJ5183細菌におけるpAdEasy-1プラスミドとpAdTrack-GFPウイルスベクターの再結合 pAdTrack-GFPの線形化と線形化されたプラスミドの精製。 氷の上に次の消化ミックスを準備します。10 μgの pAdTrack-GFP5 μL の 10x 無色バッファー2 μL の Pme IH2Oを50μLの最終体積にする。 37°Cで3時間、水浴でインキュベートします。 65°Cで20分間不活性化します。 pme Iを用いたpAdTrack-GFPの消化の効率を確認してください:0.8%アガロースゲル上の未消化プラスミドの1μgと並行して消化プラスミドの1μgを実行します。 DNAの分離と精製注:ステップ1-6はヒュームフードで行う必要があります。 消化混合物の上にフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)の等量を追加し、混合物が均一になるまでチューブを反転させます。 遠心分離機は16,200 x gで3分間、次いで、上部水相を回収管に移します。 低い有機相と渦の上に等量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)を加えます。 遠心分離機を16,200 x gで3分間、上相を同じ回収管に移します。 コレクションチューブと渦に収穫された水相の上に等量のクロロホルムを加えます。 遠心分離機は16,200 x gで3分間、次いで上水相を新しい回収管に移します。 1/10の酢酸ナトリウムを1/10に加え、2巻の冷たい100%エタノールと渦を加えます。 -70°Cで1時間、または-20°Cで一晩インキュベートする。 氷の上でサンプルを解凍し、16,200 x g および4 °Cで10分間遠心分離します。 上清を取り除き、750 μLのエタノールを加えます。 遠心分離機は16,200 x g と4°Cで3分間、上清を取り除く。 チューブを簡単に回転させて上清をすべて取り除き、フード内のペレットを乾燥させます。DNAペレットは溶解するのが難しいため、長期間乾燥しないでください。 ペレットをH2Oの15μLに溶解します。 分光光度計(例えば、ナノドロップ)を用いてDNA濃度を測定する。 pAdTrack-GFP を使用したアドナやす-1 細菌の変換注: このステップでは、pAdEasy-1 プラスミドとの pAdTrack-GFP の再結合が行われます。 メーカーの指示に従って、市販の変換キットを使用して、Adeasy-1(BJ5183含有pAdEasy-1、addgene #16399)化学コンピテント細菌を準備します。100μLのコンピテント菌のアリコートを-80°Cに保ちます。 氷の上に有能なAd容易-1細菌のアリコートを解凍し、精製されたPme I -消化pAdTrack-GFPの1 μgを追加します。チューブをフリックして軽く混ぜます(混合物をピペットしないでください)。氷の上で10分間インキュベートします。 900 μLのSOC培地を加え、37°Cで1時間、振盪してインキュベートします。 マイクロフュージは600×gで5分間。 上清の900μLを取り出し、ペレットと上清を混ぜ、変形させた細菌をLB寒天プレートにカナマイシンで種付けします。 37°Cで〜16時間インキュベート(18時間を超えないでください)。 PCRによる可能性のある陽性クローンの選択 つまようじを2つの半分に分け、オートクレーブで半爪楊枝を殺菌する。 滅菌半爪楊枝を使用して小さくて半透明のコロニーを拾います。 簡単に言えば、半爪楊枝を10μLの水(PCRチューブ)で細菌で回し、半爪楊枝をカナマイシンと100 μL SOC培地を含む1.5 mLのエペンドルフチューブに入れます。37°Cで4〜6時間インキュベートし、クローンを「陰性」および「陽性」PCRでテストします。 10 μLの水を含むPCRチューブを95°Cで5分間細菌とインキュベートし、細菌サンプルを得て「陰性」と「陽性」PCRを並行して実行します。 「ネガティブ」PCR – pAdTrack-GFPの完全性をテストする: 氷上の負のPCRのために次のPCRミックスを準備します。細菌サンプルの5 μLプライマーフォワードの0.1 μL (4631 F: 5′-CAGTAGTCGGTGTGcCGTCCAG)プライマーリバースの0.1 μL (5616 R: 5’TATGGGGTGTTGtGTGTCTC)0.1 μL の dNTP 10 mM3 μL の 5x バッファMgCl2 25mM の 1.5 μLゴタクポリメラーゼ 0.1 μLH2O を最終体積 15 μL に注: DNA テンプレートが pAdTrack-GFP ベクターである正のコントロールを含める必要があります。 「陽性」PCR-目的の遺伝子の存在を試験する。挿入した遺伝子に特異的なプライマーを使用し、前のステップと同様に混合を調製する。GFP に使用されるプライマーは次のとおりです。F: 5′-CAAGGACGGGCAACTACAR: 5′-アッググクトクトクトグッガガ 「負」と「正の」PCRを並列に実行します。PCRプログラムは:5分、95 °C;次のステップの40サイクル:30秒、95 °C;30秒、68°C;1分、72°C。最終伸び:10分、72 °C注:関心のある遺伝子を増幅するためにアニーリング温度を調整してください。 PCR産物を1%アガロースゲルで評価し、クローンを選択します。 「陽性 PCR」の後に「負の PCR」および特定の PCR 産物に PCR 産物を与えならないクローンをさらに処理することを検討してください。 選択した組換えクローンの細菌培養物を育てる 推定陽性クローンの培養物(ステップ2.4.3.)を4mLのSOC培地でカナマイシンで希釈し、37°Cで一晩揺れでインキュベートする。 Adの容易-1細菌からのプラスミドDNAの分離(アルカリ性のリシスを用いたミニプレップ) 1.5mLの細菌培養物をマイクロ遠心チューブに移し、遠心分離機を16,200xgで1分間移動し、上清を除去します。 同じチューブ内の別の1.5 mL細菌培養物を移し、遠心分離を繰り返し、上清を除去する。 200 μL のリサスペンション バッファー (50 mM グルコース、10 mM EDTA、25 mM Tris-HCl pH 8) を加えます。 溶解液(0.2 N NaOH、1%SDS)を200μL加え、チューブを反転して軽く混ぜます。 沈殿液200μL(酢酸カリウム60mL、氷酢酸11.5mL、100mLまでH2Oを加える)を加え、チューブを反転して軽く混ぜます。 16,200 x gで3分間の遠心分離機。 上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、500 μLイソプロパノールを加え、氷の上で20分間混合してインキュベートします。 遠心分離機は16,200 x g で15分間、500 μLの75%エタノールを加えます。 16,200 x g で10分間遠心分離機を出し、上清を取り除く。 遠心分離機は16,200 x gで3分間、上清を取り除き、15 μLのH2Oを加えます。 再結合されたプラスミドの増幅、分離、再テスト アドナメ−1細胞から単離されたDNAを用いてDH5α細菌の形質転換を行った。 メーカーの指示に従って、市販の変換キットを使用してDH5αの有能な細菌を準備します。 氷上のDH5αのコンピテント菌の100 μLを解凍し、組換えDNAを加え、氷の上に10分間インキュベートします。その後、カナマイシンでLB寒天プレートに細菌を播種します。 一晩で37°Cでインキュベートする。 いくつかのコロニーをピックアップし、カナマイシンとLB培地の2mLでそれぞれ成長し、37°Cで、一晩、振盪する。 DNAを分離し(アルカリ性のリシスを用いたMiniprep)、得られたDNAを25μLH2Oで再中断する。 酵素消化により陽性クローンを確認します。 氷の上に次のミックスを準備します。組換えDNA 5 μL10x無色バッファの1.5 μL0.5 μL の ヒンド III または Pst IH2O を最終体積 15 μL に 37°Cで30分間インキュベートします。注:コントロールとして、ダイジェストもpAdTrack-GFPとpAdEasy-1プラスミド。 各サンプルでは、RNase Aを使用してSx6ローディングバッファを3μL追加します(RNase Aがminiprepバッファに存在しない場合)。 消化したDNA断片を1%アガロースゲル電気泳動で実行します。注:陽性クローンの消化パターンには、pAdTrackベクターとのpAdEasy再結合を明らかにし、消化されたpAdEasyプラスミドの断片の大部分が含まれています。対象遺伝子はクローニングに使用される制限酵素による消化によって証明されるべきである。 アデノウイルスの包装のためのプラスミドDNA(トランスフェクショングレード)の調製。 プラスミドDNAを単離するために陽性クローンから細菌の200mL培養を成長させます。 プラスミドDNAミディプレップ(例えば、Qiagenプラスミドミディキット)の市販キットを使用してプラスミドDNAを分離します。 3. アデノウイルス粒子の包装 1日目。AD293細胞のシード AD293細胞をPBSで洗浄し、37°Cで2〜5分間0.125%トリプシンでインキュベートします。 血清と冷媒で細胞を収集します。 4°Cで400×gで5分間の遠心分離機。 血清で培地中の細胞を再懸濁し、〜2 x 106/T25フラスコの密度で細胞を播種する。好ましくは、フィルター付きフラスコを使用する。 1日目。Pac I で組み換えDNAを消化する 次のミックスを準備します。組換えDNA 6 μL(1 μg/μL)2 μL の Pac I2.5 μL の 10x 無色バッファH2O から最終容積 25 μL まで 37°Cで3時間(または一晩)インキュベートし、65°Cで酵素を20分間不活性化する。 エタノールでのDNA沈殿:2.5 μL(1/10 v/v)3 M酢酸ナトリウムと100%エタノールの2〜3容量を加えます。-70°Cで30分間、または-20°Cで一晩インキュベーションする。 遠心分離機は4°Cで30分間16,200xgで、滅菌水中でペレットを再懸濁します。 2日目:K2試薬を用いたAD293細胞のトランスフェクション 細胞の上にK2乗数40μLを加え、トランスフェクションの2時間前に添加します。 A および B ソリューションを準備します。解決策A:オプティ-MEMの260 μLにPac l線形化DNAを6μg加えます。ソリューションB:21.6 μLのK2試薬を248.4 μLのOpti-MEMに添加します。 溶液Aオーバー溶液Bを加え、ピペットで軽く混ぜます。 室温で20分間、混合物をインキュベートします。セルにドロップワイズAとBミックスを追加します。 3-11日目:蛍光顕微鏡によるGFP発現のモニタリング注:細胞は蛍光顕微鏡で緑色に見える必要があり、徐々に取り外す必要があります。 11日目:F1アデノウイルス粒子を収穫する 50 mLチューブに取り外した細胞と培地を集め、接着細胞を掻き取り、同じチューブに加えます。 400 x gで5分間遠心分離機を、新しいチューブに上清を集め、PBSの0.5 mLで細胞ペレットを再懸濁します。 細胞破壊 マイクロ遠心チューブに細胞懸濁液を移す。 3回の凍結/解凍サイクルを実行します(液体窒素で凍結するか、37 °Cで-80 °C /融解して最大7分) 壊れた細胞を23Gの注射針を通して3回渡す。 9,600 x g で12分間遠心分離して細胞の破片を取り除きます。 集めた培地と共に上清を50mLチューブに移します。 4. アデノウイルスの増幅 注:AD293細胞が必要な合流に達しなかった場合、感染に使用されるアデノウイルスストック(ウイルス産生細胞から得られたリセート)のアリコートは-80°Cで保存され得る。 F2アデノウイルス粒子を調製する。 AD293細胞をT75フラスコ(5 x 106 細胞/フラスコ)に播種します。 F1アデノウイルス粒子を用いて〜90%コンフルエントAD293細胞に感染する:T75フラスコで増殖した細胞の上にT25フラスコから細胞ホモジネートおよび培地を加える。 蛍光顕微鏡でGFP発現をモニターします。 トランスデューセAD293の90%が剥離した場合にウイルス産生細胞を収穫する(転写後5日目 )。細胞培養培地を4°Cに保つ。 細胞を1 mL PBSで(F1の細胞と同様に)破壊する。 F3アデノウイルス粒子を調製する。 F2アデノウイルス粒子とF2アデノウイルス粒子と細胞培養培地を用いてT175フラスコに播種したコンフルエントAD293細胞を90%感染させる。 細胞を収穫する(約5日後)。 2 mLのPBSで細胞を(F1の場合と同様に)破壊する。 F4アデノウイルス粒子を調製する。 F3アデノウイルス粒子および細胞培養培地を用いて〜90%コンフルエントAD293細胞を含む5 T175フラスコに感染する。 細胞を収穫する(約5日後)。 3 mLのPBSで細胞を(F1の細胞と同様に)破壊する。 F5アデノウイルス粒子を調製する。 F4アデノウイルスストックおよび細胞培養培地を用いて〜90%コンフルエントAD293細胞を含む25 T175フラスコに感染する。 5. 細胞のライセートおよび培養培地からのアデノウイルスの精製 ウイルス産生細胞及び培養培地を収穫する。 5日後に、F5のAD293細胞を収穫した。 アデノウイルス粒子の沈殿のために滅菌ボトルに培地を保存します。メモ:アデノウイルスを浄化するまで、冷蔵庫に媒体を保管してください。 400 x g で細胞を遠心分離し、5 分間、4 o C で 行います。 最終ペレットを10 mMトリスHClの5 mL、2 mM MgCl2でpH 8に再懸濁します。 1.5 mLチューブでサスペンションをアリコート。 細胞を破壊する(F1の細胞と同様に):凍結/解凍の3サイクル。メモ:超遠心分離をすぐに行うことができない場合は、サンプルを-80°Cに保ちます。 23G注射針を通して細胞懸濁液を3回通過する。 ホモジェン酸を9 600xgで遠心分離し、12分間用いた。 CsClの勾配超遠心化によるアデノウイルス精製のための上清を保存する。 培養培地中に放出されたアデノウイルスの沈殿。 保存した細胞培養液を室温でボトルに持参します。 細胞培養培地の500mLごとに121gの硫酸アンモニウムを加える(溶液の飽和度は40〜42%)。 硫酸アンモニウムが完全に溶解するまで慎重に混合する。 室温で最低2.5時間インキュベートします。 遠心分離機1600xg、15分間 、22oCでペレットを保存します。 2mM MgCl2で 10mM トリス HCl pH 8 の 4 mL でペレットを再懸濁します。この懸濁液は、CsClの勾配超遠心分離によって直ちに精製されるべきである。注:精製ステップを後で行うことができない場合、透析は10mMトリスHClに対して再懸濁されたペレットを、2mM MgCl2でpH 8。 超遠心分離によるアデノウイルス精製。 SW41Tiローター用ポリプロピレンチューブで不連続なCsCl勾配を準備します。チューブの下部に765 mg/mL CsCl(高密度:1.4 g/L)の3 mLを加えます。最初の CsCl 層の上に 288.5 mg/mL CsCl (低密度: 1.2 g/L) の 3 mL をゆっくりと加えます。 細胞から放出されたアデノウイルス粒子懸濁液の3〜4mLを、または細胞培養培地から沈殿した(前述の通り)勾配の上に静かに重ね合わせる。 ミネラルオイルでチューブを充填し、冷たいSW41Tiバケットにチューブを入れます。 チューブを平衡にします。充填されたポリプロピレンチューブがローターに対称的にロードされていることを確認してください。ローターを超遠心分離機に入れます。 210,000 x g および4°Cで遠心分離機、18時間、ブレーキなし。 バンドを得るために後ろに黒い紙でスタンドに超遠心チューブを置きます。 透明な上相、細胞の破片、および漂白液を用いた廃容器内の上部バンドを廃棄する。 完全なアデノウイルス(〜700 μL~1 mL)を含む最も低いバンドを無菌1.5mLチューブに収穫し、氷の上に保管してください。 透析バッファー内の透析カセットを予め濡らします (10 mM Tris-Cl バッファー pH 8, 2 mM MgCl2)。 精製したアデノウイルスを2mLの注射器を使用して透析カセットに注入します。 透析は10 mM Tris-ClバッファーpH 8、2 mM MgCl2 に対して一晩(透析バッファーを3〜4回変更する) 10-100 μLのアリコートで透析カセットからアデノウイルスストックを収穫します。 ウイルスアリコートに4%の最終濃度にスクロースを加える(凍結保護用)。 アリコートは-80°Cで保管してください。 6. アデノウイルス滴定 1日目:細胞をめっきする AD293細胞を、図2に示すように、1mL完全増殖培地に1mLで(12ウェル培養プレートで)1ウェルあたり2.5×10個の細胞の密度で播種する。正確な気性の決定のために、細胞が各ウェルに均等に広がっていることを確認してください。 図2:滴定板設計この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 2日目:細胞の細胞の導入 トリプシンで1つの井戸から細胞を取り外し、それらを数えます。この数値は、ウイルス価の計算に使用されるため注意してください。 完全な成長培地の1 mLでウイルスストックの連続希釈を行う (1/104;1/105;1/106;1/107)以下のように: 1/103: ウイルスストックの希釈 – 完全な培地の1998 μLに2μLのウイルスストックを加える。 1/104: 120 μLを完全培地(A)の1080 μLに希釈して1/103 の1:10希釈を行います。 1/105: 完全培地(B)の120μLを1080μLに希釈して、Bを1:10希釈します。 1/106: 完全培地(C)の120 μLを1080 μLに希釈してCを1:10希釈します。 1/107: 完全培地(D)の120 μLを1080 μLに希釈してDを1:10希釈します。注:各希釈液(A、B、C、D)の3つのチューブを準備して、三重で実験を行います。 ウェルから細胞培養培地を取り出し、ウイルスの調製された希釈液を追加します( 図2を参照)。 3日目:GFP表現のモニタリング 蛍光顕微鏡を用いて、緑色細胞の存在を調べてください。 4日目:GFP陽性細胞のフローサイトメトリー解析 12個の1.5mLチューブを準備し、ラベルを付けます。 1.5 mLのチューブに細胞培養培地(脱離した細胞と一緒に)を集め、氷の上に保管します。 各ウェルに200μLのトリプシンを加えます。 CO2インキュベーターで37°Cでプレートを2〜3 分間インキュベートします。 細胞培養培地と同じエペンドルフチューブ内の細胞を収穫する。チューブを氷の上に置いておきなさい。 細胞を400xgでペレット、5分間、4°Cで。 上清を取り除く。チューブを氷の上に置いておく。 PBS + 2% FBS の 250 μL でペレットを再懸濁します。チューブを氷の上に置いておく。 フローサイトメトリーチューブまたはプレートで細胞懸濁液を移動します。 GFP発現細胞の蛍光を記録するフローサイトメーター上でサンプルを実行します。Titer 計算: 親集団から 5 – 20% GFP 陽性セルを持つサンプルは、次の式を使用してウイルスの活用量の計算に考慮する必要があります。タイター(TU/mL) = D x F/100 x C/VD = 希釈係数F = 陽性細胞のパーセント / 100C = セルの数 / ウェルV = ウイルス性接種量 7. 標的細胞のアデノウイルス伝達と誘導タンパク質発現の試験 1 日目: セルのシード処理 ターゲット細胞をシードし、ウェルに均等に広がっていることを確認します。 2日目:細胞の導入 ターゲット セルを 1 つのウェルから切り離し、カウントします。 細胞当たりの感染性粒子の所望の数で細胞をトランスデュースするために必要なアデノウイルス懸濁液の適切な容積を計算する。 標的細胞に対応する量のウイルス懸濁液を加える。 3日目:ウイルス懸濁液の除去とGFP発現の確認 アデノウイルス粒子を含む細胞培養培地を新鮮な培地で交換する。 蛍光顕微鏡でGFPの発現を確認してください。