Hier stellen wir ein Protokoll für die Adenovirus-Produktion mit dem pAdEasy-System vor. Die Technologie umfasst die Rekombination der Plasmide pAdTrack und pAdEasy-1, die Adenovirus-Verpackung und -Verstärkung, die Reinigung der adenoviralen Partikel aus Zelllysat und Kulturmedium, die virale Titration und die funktionelle Prüfung des Adenovirus.
Die adenovirale Transduktion hat den Vorteil einer starken und vorübergehenden Induktion der Expression des Gens von Interesse in eine Vielzahl von Zelltypen und Organen. Die rekombinante adenovirale Technologie ist jedoch mühsam, zeitaufwändig und teuer. Hier präsentieren wir ein verbessertes Protokoll mit dem pAdEasy-System, um gereinigte adenovirale Partikel zu erhalten, die eine starke grüne fluoreszierende Proteinexpression (GFP) in transduzierten Zellen induzieren können. Die Vorteile dieser verbesserten Methode sind eine schnellere Vorbereitung und geringere Produktionskosten im Vergleich zur ursprünglichen Methode, die bert Vogelstein entwickelt hat. Die wichtigsten Schritte der adenoviralen Technologie sind: (1) die Rekombination von pAdTrack-GFP mit dem pAdEasy-1 Plasmid in BJ5183 Bakterien; (2) die Verpackung der adenoviralen Partikel; (3) die Amplifikation des Adenovirus in AD293-Zellen; (4) die Reinigung der adenoviralen Partikel aus Zelllysat und Kulturmedium; und (5) die virale Titration und funktionelle Tests des Adenovirus. Die Verbesserungen der ursprünglichen Methode bestehen aus (i) der Rekombination in BJ5183-haltigen pAdEasy-1 durch chemische Umwandlung von Bakterien; ii) die Auswahl rekombinanter Klone durch “negative” und “positive” PCR; iii) die Transfektion von AD293-Zellen unter Verwendung des Transfektionssystems K2 für adenovirale Verpackungen; iv) die Ausfällung der von AD293-Zellen im Zellkulturmedium freigesetzten Viruspartikel mit Ammoniumsulfat; und (v) die Reinigung des Virus durch einstufige Cäsiumchlorid-Diskontinuierliche Gradienten-Ultrazentrifugation. Eine starke Expression des Gens von Interesse (in diesem Fall GFP) wurde in verschiedenen Arten von transduzierten Zellen (wie Hepatozyten, Endothelzellen) aus verschiedenen Quellen (Mensch, Rind, Murin) erhalten. Der adenoviral-vermittelte Gentransfer ist eines der wichtigsten Instrumente für die Entwicklung moderner Gentherapien.
Adenoviren sind nicht umhüllte Viren, die ein Nukleocapsid und ein doppelsträngiges lineares DNA-Genom1,2,3enthalten. Adenoviren können eine breite Palette von Zelltypen infizieren und Infektionen sind nicht von der aktiven Wirtszellteilung abhängig. Nach der Infektion führt das Adenovirus seine genomische DNA in den Zellzellkern ein, wo es epichromosomal bleibt und zusammen mit den Genen des Wirts transkribiert wird. Somit wird ein minimales potenzielles Risiko für Insertionsmutagenese oder Onkogenes-Regulierung erreicht4,5,6. Das adenovirale Genom wird nicht zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert und somit werden die adenoviralen Gene in einer teilenden Zellpopulation verdünnt. Zu den Vorteilen der adenoviralen Transduktion gehören: (i) hohe Transgenexpression; ii) verringerte Risiken im Zusammenhang mit der Integration der viralen DNA in das Wirtsgenom aufgrund episomaler Expression; iii) Transduktion einer Vielzahl von teilenden und nicht trennenden Zelltypen. Die meisten Adenoviren, die in der biomedizinischen Forschung verwendet werden, sind nicht reproduzierbar, ohne die E1-Region7,8,9. Für ihre Produktion ist eine Zellleitung erforderlich, die die E1-Sequenz (z. B. HEK293) liefert. Außerdem wurde eine nicht-essentielle Region für den viralen Lebenszyklus (E3) gestrichen, um die Einfügung eines Transgens in das virale Genom zu ermöglichen; andere Regionen (E2 und E4) wurden bei einigen Adenoviren weiter gestrichen, aber in diesen Fällen wurde ein geringer Ertrag der adenoviralen Produktion und eine geringe Expression des Transgens berichtet7.
Hier stellen wir ein verbessertes Protokoll zum Erstellen, Verpacken und Reinigen der Adenoviren mit dem AdEasy-System vor. Diese Verbesserungen ermöglichten die Verpackung des Adenovirus in einer schnelleren und wirtschaftlicheren Weise im Vergleich zu der ursprünglichen Methode von Bert Vogelstein2,10entwickelt , aufgrund der folgenden Vorteile: (i) die Rekombination in BJ5183-haltigen pAdEasy-1 durch chemische Umwandlung von Bakterien; ii) die Auswahl der rekombinanten Klone nach PCR; iii) die Transfektion von AD293-Zellen unter Verwendung des Transfektionssystems K2 für adenovirale Verpackungen; iv) die Ausfällung adenoviraler Partikel aus kulturmedium nach viraler Verpackung und Amplifikation; v) die adenovirale Reinigung mit einstufigem Cäsiumchlorid (CsCl) Gradienten-Ultrazentrifugation.
Das Protokoll für die Adenovirus-Produktion mit dem AdEasy-System (Abbildung 1) umfasst die folgenden Schritte:
(1) Rekombination von pAdTrack-GFP mit pAdEasy-1 in BJ5183 Bakterien
(2) Verpackung der adenoviralen Partikel
(3) Verstärkung des Adenovirus
(4) Reinigung der adenoviralen Partikel aus Zelllysat und Kulturmedium
(5) Adenovirus-Titration.
Abbildung 1: Die Adenovirus-Produktionstechnologie. Die wichtigsten Schritte der adenoviralen Technologie sind: (1) Die Rekombination des pAdTrack-GFP mit dem pAdEasy-1 Plasmid in BJ5183 Bakterien. Die ausgewählten rekombinierten Plasmide werden in DH5-Bakterien verstärkt und anschließend gereinigt; (2) Die Verpackung der adenoviralen Partikel in AD293-Zellen, die Adeno-E1-Proteine produzieren; (3) Die Amplifikation des Adenovirus in AD293-Zellen; (4) die Reinigung der adenoviralen Partikel aus dem Zelllysat und des Kulturmediums durch Ultrazentrifugation auf einem CsCl-Dichtegradienten; (5) Die Titration des Adenovirus und die funktionellen Tests. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In diesem Protokoll haben wir die Technologie zur Herstellung des Adenovirus exemplarisch dargestellt, die die Expression von GFP in den Wirtszellen induzieren kann. GFP wird bereits im Backbone des pAdTrack-CMV-Shuttlevektors (Addgene #16405) unter einem zweiten CMV-Promotor eingesetzt und wird als Reportergen verwendet (Abbildung 1). Aus diesem Grund haben wir hier den pAdTrack-CMV-Vektor als pAdTrack-GFP bezeichnet und die Expression von GFP für Demonstrativzwecke bewertet. Neben der GFP-Expression kann das System verwendet werden, um ein Gen von Interesse zu überprimieren, das in den mehrfachen Klonstellen der pAdTrack-CMV geklont werden kann. Ein im pAdTrack-CMV geklontes Gen oder Minigen ist in der Regel effizienter für die Expressionsinduktion als die cDNA11. Die Daten zeigten eine starke GFP-Expression in transduzierten Zellen (wie Hepatozyten, Endothelzellen) aus verschiedenen Quellen (Mensch, Rind, Murin). Der adenoviral-vermittelte Gentransfer ist eines der wichtigsten Instrumente für die Entwicklung moderner Gentherapien.
Rekombinante Adenoviren sind ein vielseitiges Werkzeug für die Genabgabe und Expression12,13,14. Um eine starke Proteinexpression durch adenovirale Transduktion zu induzieren, wird die Kodierungssequenz des Gens von Interesse in das Genom des Adenovirus eingefügt. Das adEasy adenovirale System, das im Labor von Bert Vogelstein entwickelt wurde, besteht aus einem Backbone-Plasmid (pAdEasy-1), das den größten Teil des Wilden-Adenovirus-Serotyp-5-Genoms enthält, und einem Shuttle-Vektor (pAdTrack), der für das Klonen vonGenen2,10. Die Deletion der adenoviralen Gene E1 (zuständig für die Montage von infektiösen Viruspartikeln) und E3 (kodierungsproteine Proteine, die an der Umgehung der Wirtsimmunität beteiligt sind) schuf einen Raum im adenoviralen Genom, in dem ein Gen von Interesse von 6,5-7,5 kb eingefügt werden kann2,3. Diese Größe ist ausreichend für viele Gene, vor allem für diejenigen mit kürzeren Introns15,16,17. Es gibt auch Forscher, die über die Produktion von Adenoviren berichten, die die cDNA eines Transgens18,19,20tragen. Wir erhielten jedoch eine geringere Ausbeute an transgener Expression für cDNA-tragende Adenoviren als für ihre Gegenstücke, die ein Gen oder ein Mini-Gen tragen (Daten nicht gezeigt).
Die Verbesserung und Anpassung der bisherigen Methoden2,10,14,18,21, die Technologie für die adenovirale Produktion erfordert eine kürzere Zeit, geringere Kosten und weniger Aufwand. Die adenovirale DNA in voller Länge wird durch Rekombination zwischen dem Shuttle-Vektor und dem pAdEasy-1-Plasmid in der homologen Rekombination anfälligen E. coli-Stamm, BJ5183, erhalten. Das Protokoll impliziert die chemische Umwandlung von AdEasier-1-Zellen (BJ5183-Bakterien, die pAdEasy-1 enthalten). Diese Technik erfordert keinen Elektroporator, der in einigen Laboratorien möglicherweise nicht verfügbar ist, sehr einfach ist, die Rekombinationsausbeute erhöht und die Zeit reduziert, die erforderlich ist, um kompetente Zellen zu erhalten und die Transformation durchzuführen. Die Vorauswahl rekombinanter Klone, die von PCR durchgeführt werden, verkürzt die Zeit weiter und erleichtert den gesamten Ablauf. Ein ähnliches Verfahren wurde von Zhao und Kollegen22verwendet, aber im Protokoll optimierten wir die Sequenzen der Primer.
Für die GFP-Adenovirus-Verpackung und -Verstärkung wurde eine HEK293-Derivatzelllinie verwendet, nämlich AD293-Zellen, die stärker an der Kulturplatte haften. Andere Zelllinien, die häufig für die adenovirale Produktion verwendet werden, sind die folgenden: 911, 293FT, pTG6559 (A549 Derivat), PER. C6 (HER-Derivat), GH329 (HeLa-Derivat), N52. E6 und HeLa-E123,24,25,26. In unseren Händen wurde keine Verbesserung der adenoviralen Produktion erzielt, als 911 Zellen verwendet wurden (Daten nicht gezeigt). Die Transfektion von AD293-Zellen mit dem rekombinanten Plasmid mit K2-Reagenz steigerte die Effizienz des viralen Verpackungsschritts stark. Nach der Adenovirus-Produktion befinden sich bis zu 70 % des Adenovirus noch in den Zellen und werden durch drei Gefrier- und Auftauzyklen freigesetzt. Die Erhöhung der Anzahl der Zyklen ist nicht geeignet, weil es das Adenovirus zerstört.
Während des routinemäßigen adenoviralen Produktionsprozesses werden zahlreiche virusvirale Partikel im Zellkulturmedium freigesetzt. Die Verwirft dieses Zellkulturmediums während der Ernte der infizierten AD293-Zellen würde zu einem wichtigen viralen Verlust führen. Wir haben das von Schagen und Kollegen beschriebene Protokoll optimiert, um die adenoviralen Partikel aus dem Zellkulturmedium durch Niederschlag mit Ammoniumsulfat27zu reinigen. Diese Methode hat eine höhere Effizienz in adenovirus Erholung aus dem Zellkulturmedium im Vergleich zu der Methode mit Polyethylenglykol28. Das gefällte Adenovirus sollte sofort durch Ultrazentrifugation gereinigt oder für ein paar Tage im Kühlschrank aufbewahrt werden, aber nur nach der Dialyse, um den Salzüberschuss zu entfernen. Den Niederschlag länger als ein paar Stunden ohne Dialyse zu halten, ist schädlich für das Virus.
Die Reinigung der adenoviralen Partikel durch ultrazentrifugierende Partikel in einem Schritt reduziert die Manipulation des adenoviralen Bestands und erleichtert das Verfahren im Vergleich zu den Protokollen mit aufeinanderfolgenden Ultrazentrifugationsschritten14,29. Die Dialyse des gereinigten Adenovirus ist notwendig, um Cäsiumchlorid zu entfernen, das die Transduktion weiter beeinträchtigen kann. Im Protokoll verwendeten wir Tris-Puffer, der MgCl2, aber nicht Saccharose für die Dialyse enthält, da es eine riesige, ungerechtfertigte Menge Saccharose erfordert, die sonst als Konservierungsmittel zum Einfrieren benötigt wird. So fügten wir Saccharose später direkt in die adenoviralen Bestände ein, die zum Einfrieren vorbereitet wurden. Um ein häufiges Einfrieren und Auftauen des gereinigten Adenovirus zu vermeiden, ist es ratsam, die adenoviralen Bestände zu aliquotieren und bei -80 °C zu lagern. Der adenovirale Titer wurde durch Durchflusszytometrie unter Berücksichtigung des GFP-Reportergens und des Prozentsatzes der transduzierten Zellen für eine bestimmte virale Verdünnung bewertet. Diese Methode ist schneller im Vergleich zum klassischen “Plaque-Assay” und ist vertrauensvoller als die Auswertung der Kapsidproteine (durch verschiedene Methoden wie ELISA oder Durchflusszytometrie), die nicht die Fähigkeit der Infektion der adenoviralen Partikel offenbaren. ELISA-basierte Quantifizierung, Q-PCR oder Plaque-Assay mit kommerziell erhältlichen Kits sind jedoch alternative Methoden, die besonders nützlich für die Titration von Adenoviren sind, die keinen fluoreszierenden Tracer enthalten.
In Anbetracht der Tatsache, dass pAdTrack-Adenoviren von menschlichen Adenoviren Serotyp 5 abgeleitet sind, der durch Coxsackievirus und Adenovirus-Rezeptoren (CAR) erkannt wird, haben wir die Fähigkeit des GFP-Adenovirus demonstriert, Zellen menschlichen Ursprungs (Endothelzellen), aber auch Zellen anderer Herkunft zu transduzieren, aber auch Zellen anderer Herkunft: Rinder (Endothelzellen) und Murine (mesenchymale Stromzellen). Die Daten zeigten, dass das GFP-Adenovirus eine hohe Expression eines Transgens induzieren kann.
Zusammenfassend haben wir diese mühsame Technologie optimiert, um die Zeit, die Kosten und den Aufwand zu reduzieren, der erforderlich ist, um die adenoviralen Partikel zu erhalten. Das hergestellte Adenovirus ist in der Lage, verschiedene Zelltypen zu infizieren und die Expression des Gens von Interesse zu induzieren. Dieses Protokoll kann in einer Vielzahl von Experimenten verwendet werden, da der adenoviral-vermittelte Gentransfer eines der wichtigsten Werkzeuge für die Entwicklung moderner Gentherapien darstellt.
ABBREVIATIONS: AdV-GFP, adenovirale Partikel; BAEC, aortenatotäre Endothelzellen; CsCl, Cäsiumchlorid; GFP, grünes fluoreszierendes Protein; MSC, mesenchymale Stromalzellen; TU, Messeinheiten.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch ein Projekt unterstützt, das aus dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung aus dem operationellen Programm für Wettbewerbsfähigkeit 2014-2020 (POC-A.1-A.1.1.4-E-2015, ID: P_37_668; Akronym DIABETER), ein Stipendium des rumänischen Ministeriums für Forschung und Innovation PCCDI- UEFISCDI, Projektnummer PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697 innerhalb der PNCD III und der Rumänischen Akademie. Die Autoren danken Kyriakos Kypreos (Universität Patras, Griechenland) für seine großzügige und sachdienliche Beratung, Ovidiu Croitoru (Universität der Schönen Künste, Bukarest, Rumänien) für Dreharbeiten, Filmschnitt und grafisches Design und Mihaela Bratu für technische Hilfe.
AD293 cells | Agilent Technologies | 240085 | |
AdEasier-1 cells | Addgene | 16399 | |
Agarose I (for electrophoresis) | Thermo Scientific | 17850 | |
Ammonium sulfate | Sigma | A4418 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma | A0166 | |
BamH I | Thermo Scientific | FD0054 | |
Cell culture plates 100 mm | Eppendorf | 30702115 | |
Cesium chloride | Sigma | L4036 | |
DH5alpha bacteria | Thermo Scientific | 18265017 | |
DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose) | Gibco | 3240-027 | |
EA.hy926 cells | ATCC | CRL-2922 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Ethanol (99.8%) | Roth | 5054.2 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F7524 | |
Flasks T25, T75, T175 | Eppendorf | 30712129 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Hepa 1-6 murine hepatocytes | ATCC | CRL-1830 | |
Hind III | Thermo Scientific | FD0504 | |
Kanamycin Sulfate | Thermo Scientific | 15160054 | |
K2 Transfection System | Biontex | T060-5.0 | |
LB medium | Formedium | LBx0102 | |
LB-agar | Formedium | LBx0202 | |
Mix & Go E. coli Transformation kit | Zymo Research | T3001 | |
Midori Green Advanced DNA stain | Nippon Genetics Europe | MG-04 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Opti-MEM | Thermo Scientific | 31985070 | |
Pac I | Thermo Scientific | FD2204 | |
pAdEasy-1 | Addgene | 16400 | |
pAdTrack-CMV | Addgene | 16405 | |
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (24:24:1) | Invitrogen | 15593-031 | |
Polymerase GoTaq | Promega | M3005 | |
Pme I (Mss I) | Thermo Scientific | FD1344 | |
Potassium acetate | VWR Chemicals | 43065P | |
Pst I | Thermo Scientific | FD0614 | |
Qiagen Midi Prep kit | Qiagen | 12125 | |
Cell Scraper | TPP | 99003 | |
SDS | Thermo Scientific | 28365 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66330 | |
Sodium pyruvate | SIGMA | P5280-100G | |
Syringe with 23G neeedle | B Braun | 464BR | |
Tris HCl | Sigma | 1185-53-1 | |
Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
Tubes 50ml | TPP | 91050 | |
Ultra-Clear Tubes (14×89 mm) | Beckman Coulter | 344059 | |
Centrifuge (refrigerated) | Sigma Sartorius | 3-19KS | |
HeraeusFresco 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | |
Ultracentrifuge with SW41Ti rotor | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | |
Culture Hood | Thermo Scientific | Class II | |
Pipettes (0-2µl, 1-10µl, 2-20µl, 10-100µl, 20-200µl, 100-1000µl) | Thermo Scientific | ||
Dry Block Heating Thermostat | Biosan | TDB-120 | |
Thermocycle | SensoQuest | 012-103 | |
Water Bath | Memmert | WNB 14 |