Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi
Summary
Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA’ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA’ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.
Abstract
Gen transkripsiyon, hücre biyolojisinde önemli bir süreçtir ve hücrelerin iç ve dış ipuçlarını yorumlamasına ve yanıt vermesine izin verir. mRNA düzeylerini ölçen geleneksel toplu popülasyon yöntemleri (Kuzey blot, PCR ve RNAseq), yanıtlarda hücreden hücreye varyasyon hakkında bilgi sağlama yeteneğinden yoksundur. Hassas tek hücreli ve alelik görselleştirme ve niceleme, tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH) ile mümkündür. RNA-FISH, hedef RNA’ların etiketli oligonükleotid problarla hibridize ederek gerçekleştirilir. Bunlar orta/yüksek aktarım hızı yöntemleriyle görüntülenebilir ve görüntü analizi işlem hatları aracılığıyla, hem olgun hem de nascent RNA’lar üzerinde tek hücre düzeyinde nicel veriler sağlar. Fiksasyon, permeabilizasyon, hibridizasyon ve görüntüleme adımları, burada açıklanan model sistemi kullanılarak laboratuvarda uzun yıllar boyunca optimize edilmiştir ve bu da smFISH etiketlemesinin başarılı ve sağlam tek hücre analizi ile sonuçlanır. Numune hazırlama ve işleme ile temel amaç, yanlış pozitifleri azaltmak ve daha doğru veriler sağlamak için yüksek sinyal-gürültü oranı ile karakterize yüksek kaliteli görüntüler üretmektir. Burada, belirli örneklere uyarlamak için öneriler ve optimizasyon adımlarıyla birlikte numune hazırlamadan veri analizine kadar işlem hattını açıklayan bir protokol sunuyoruz.
Introduction
Gen transkripsiyon ve çeviri, DNA dizisinden RNA’ya ve protein1’ekadar biyolojinin merkezi dogmasında yer alan iki ana süreçtir. Bu çalışmada transkripsiyon sırasında haberci RNA (mRNA) üretimine odaklanıyoruz. Nascent RNA molekülü hem kodlamayan intronları hem de kodlama eksonlarını içerir. Intronlar, mRNA ribozomlar üzerinde çeviri için sitoplazma hareket etmeden önce eş-transkripsiyonel olarak birlenir2,3.
Geleneksel olarak, mRNA ölçümü, RT-qPCR veya Kuzey şişkinliği gibi klasik tahlillerle hücrelerin toplu popülasyonlarında (yüzlerce ila milyon) gerçekleştirilir. Çok güçlü olsa da, bu yöntemler hücreden hücreye varyasyon (fenotipik heterojenlik), transkripsiyonel olarak aktif alellerin sayısının tanımlanması ve belki de daha da önemlisi mekansal bilgi eksikliği hakkında içgörü sağlamadıkları için sınırlıdır. Daha yakın zamanda, tek hücreli RNA dizilimine (RNAseq) izin sağlayan genom geniş teknolojileri görüntüleme yöntemleri ile sıralama4arasındaki boşluğu kapatmaya başladı. Bununla birlikte, RNAseq nispeten düşük algılama verimliliklerinden muzdariptir ve işleme adımları uzamsal bilgilerin tamamen kaybolmasına neden5. Tek hücreli RNAseq, izojenik hücre popülasyonu arasında fenotipik heterojenlik hakkında içgörüler sağlayabilse de, RNA floresan in situ hibridizasyon (RNA-FISH) mekansal düzeyde ve aletle bazında hedef gen ekspresyonunun daha eksiksiz bir şekilde araştırılmasını kolaylaştırabilir6,7.
RNA FISH, sabit hücrelerdeki hedef RNA moleküllerinin tespitini ve lokalizasyonunu sağlayan bir tekniktir. Daha önceki, zahmetli yöntemlerden farklı olarak, mevcut son teknoloji RNA-FISH, hedef RNA dizilerinin tamamlayıcısı olan ticari olarak mevcut nükleik asit problarını kullanır ve bu problar Watson-Crick tabaneşleştirmesi 8ile hedeflerine melezlenir. Erken yerinde hibridizasyon teknikleri, Gall ve Pardue tarafından 1969’da kurulan benzer bir protokolü içeriyordu, çünkü bir örnek özellikle bir hedef RNA9’amelezlenen nükleik asit probları ile işlendi. Başlangıçta test radyoaktif veya kolorimetrik algılama kullanılarak gerçekleştirildi; bununla birlikte, 1980’lerde, DNA FISH ve daha sonra RNA FISH’e floresan in situ hibridizasyon (FISH) protokollerinin geliştirilmesi, daha hassas tespite giden yolu ve çoklama potansiyelini10,11‘e açtı.
RNA FISH’teki diğer gelişmeler, tek RNA moleküllerini (smFISH)12 , 13tespit etme ve ölçmeyeteneğineyolaçmıştır. Doğrudan algılama, probların kendilerinin floroforlarla etiket edildiği bir yöntemdir. SmFISH ile ilgili bir zorluk, floresan sinyallerin farklı, kırınım sınırlı noktalar olarak algılanmasını kolaylaştırmak için yeterli melezleme problarına / hedefine ihtiyaç olmasıdır. Bu sorunu gidermek için, hedef RNA 8,12,14’ünçeşitli bölgelerine tamamlayıcıkısa tek iplikli DNA oligonükleotidlerinden oluşan bir prob kümesi kullanılabilir. Birden fazla probun bağlanması yerel florofor yoğunluğunu arttırır ve RNA’yı floresan mikroskopi ile belirgin, yüksek yoğunluklu bir nokta olarak görünür hale getirir. Bu yöntem avantajlıdır, çünkü prob kümesi havuzundaki oligonükleotidlerin hedef dışı bağlanması, gerçek sinyal ve sahte oligonükleotid bağlama arasında ayrım yapmak için spot boyutunu ve yoğunluğunu nicel olarak analiz ederek gerçek RNA spot sinyalinden ayırt edilebilir, böylece yanlış pozitifleri azaltarak daha doğru analizleri kolaylaştırır12.
mRNA’yı tespit etmek için alternatif yöntemler klasik BAC klon tabanlı nick çeviri yöntemi ve daha yeni geliştirilen dallı DNA sistemidir. BAC klonlanmış, nick çeviri yönteminde, etiketlenecek DNA enzimmatik olarak çalınır ve maruz kalan 3′ uca yeni bir nükleotid eklenir. DNA polimerazının aktivitesi I, istenen prob15 , 16ile sonuçlanan etiketli bir nükleotid ekler. Dallı DNA tekniği, RNA hedeflerine çiftler halinde melezlenen oligonükleotid probları içerir ve bu problar birden fazla sinyal amplifikasyon molekülü kullanılarak yükseltilir. Bu yöntem sinyal-gürültü oranını önemli ölçüde artırabilir, ancak floresan lekeler boyut ve yoğunluk bakımından çılgınca farklı olabileceğinden amplifikasyon doğru miktarlamayı çarpıtabilir17.
Galveston Körfezi/Houston Gemi Kanalı’nda endokrin bozucu kimyasalların etkilerini ölçmek için NIEHS Superfund Araştırma Programı katılımının bir parçası olarak tam olarak kullanılan bu protokol için bir model sistem olarak, bir ER agonisti, 17β-estradiol (E2) 7 ,18,19 ile bir gecede tedavi edilen östrojen reseptör (ER) pozitif meme kanseri hücre hattı MCF-7’yi kullandık. E2, prototipik ER hedef geni, GREB17, 20,21,22dahil olmak üzere birçok ER-hedef geni düzenler. Burada açıklanan smFISH protokolü, GREB1’i hedefleyen iki spektral olarak ayrılmış prob kümesinden yararlanır; biri akonlara ve diğeri intronlara melezlenerek hem olgun hem de nascent RNA7’ninölçülenliğine izin verir. Daha sonra görüntü smFISH etiketli örneklere dekonvolüsiyon ile birlikte epifluoresans mikroskopisi kullanıyoruz ve ardından hücre başına aktif alel ve olgun RNA’ların sayısını ölçmek için görüntü analizi rutinleri uyguluyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan smFISH metodolojisi daha önce yayınlanan7, 12,14protokollerine dayanmaktadır. Bu protokolde, ıslak laboratuvardan (tohumlama yoğunluğu, sabitleme süresi, permeabilizasyon ve prob konsantrasyonu dahil) görüntüleme ve görüntü analizine kadar optimize edilen kritik adımları açıklıyoruz ve gen transkripsiyonunun tek hücreli analizini yapmak isteyen laboratuvarlar için tam bir deneysel boru hattı sağ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MAM, FS ve MGM NIEHS (Proje 4, P42ES027704, PI, Rusyn) tarafından finanse edilmektedir. MAM, FS, RMM, MGM ve PKS, CPRIT tarafından finanse edilen GCC İleri Mikroskopi ve Görüntü Bilişim Merkezi (RP170719) tarafından desteklenmektedir. Görüntüleme ayrıca Baylor College of Medicine’daki Entegre Mikroskopi Çekirdeği tarafından NIH (DK56338 ve CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Kapsamlı Kanser Merkezi ve John S. Dunn Gulf Coast Kimyasal Genomik Konsorsiyumu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
References
- Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).
- Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
- Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
- Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
- Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
- Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
- Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
- Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
- Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
- Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
- Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
- Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
- Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
- Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
- Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
- Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
- Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
- Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
- Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
- Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
- Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
- Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
- Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
- Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
- Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
- Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
- Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).
