Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Transcrição genética e tradução são os dois principais processos envolvidos no dogma central da biologia, indo da sequência de DNA para RNA para proteína¹. Neste estudo, focamos na produção de RNA mensageiro (mRNA) durante a transcrição. A molécula nascente de RNA inclui introns não codificadores e exons de codificação. Os introns são co-transcriçãoseticamente emendados antes que o mRNA se mova para o citoplasma para tradução nos ribossomos^2,3.

Tradicionalmente, a medição do mRNA é realizada em populações a granel de células (centenas a milhões) com ensaios clássicos como RT-qPCR ou mancha norte. Embora muito poderosos, esses métodos são limitados, pois não fornecem insights sobre a variação célula-celular (heterogeneidade fenotípica), identificação do número de alelos ativos transcricionalmente e, talvez mais importante, falta de informações espaciais. Mais recentemente, as tecnologias de genoma amplo que permitem o sequenciamento de RNA de células únicas (RNAseq) começaram a fazer a ponte entre os métodos de imagem e o sequenciamento⁴. No entanto, a RNAseq sofre de eficiências de detecção relativamente baixas e as etapas de processamento resultam em perda completa de informações espaciais⁵. Embora a rnAseq unicelular possa fornecer insights sobre a heterogeneidade fenotípica entre uma população de células isogênicas, a fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) pode facilitar uma exploração mais completa da expressão genética-alvo no nível espacial, e em uma base de aleelo por alelo^6,7.

RNA FISH é uma técnica que permite a detecção e localização de moléculas de RNA alvo em células fixas. Ao contrário dos métodos anteriores e trabalhosos, o RNA-FISH de última geração utiliza sondas de ácido nucleico comercialmente disponíveis que são complementares às sequências de RNA alvo, e essas sondas hibridizam seus alvos pelo emparelhamento base Watson-Crick⁸. As técnicas iniciais de hibridização in situ envolveram um protocolo semelhante estabelecido por Gall e Pardue em 1969, uma vez que uma amostra foi processada com sondas de ácido nucleico que especificamente hibridizadas para um RNA⁹alvo . Originalmente, o ensaio foi realizado utilizando-se detecção radioativa ou colorimétrica; no entanto, na década de 1980, o desenvolvimento da fluorescência nos protocolos de hibridização situ (FISH) para o DNA FISH e posteriormente RNA FISH abriu o caminho para uma detecção mais sensível, e o potencial de multiplexação^10,11.

Outros desenvolvimentos no RNA FISH levaram à capacidade de detectar e quantificar moléculas de RNA únicas (smFISH)^12,13. A detecção direta é um método no qual as próprias sondas são rotuladas com fluoroforos. Um desafio com o smFISH é que há necessidade de sondas/alvos hibridizadores suficientes para facilitar a detecção de sinais fluorescentes como pontos distintos e limitados por difração. Para resolver esse problema, pode-se usar um conjunto de sondas de oligonucleotídeos de DNA de uma única vez complementares a várias regiões do RNA^8,12,14. A ligação de múltiplas sondas aumenta a densidade fluorófora local, tornando o RNA visível como um ponto distinto e de alta intensidade por microscopia de fluorescência. Este método é vantajoso porque a ligação fora do alvo de oligonucleotídeos no pool de conjuntos de sondas pode ser distinguida do verdadeiro sinal spot do RNA, analisando quantitativamente o tamanho e intensidade do spot para diferenciar entre o verdadeiro sinal e a ligação espúria de oligonucleotídeos, facilitando assim uma análise mais precisa através da redução de falsos positivos¹².

Métodos alternativos para detectar mRNA são o clássico método de tradução nick baseado em clones BAC e o sistema de DNA ramificado mais recentemente desenvolvido. No método clonado por BAC, nick-translation, o DNA a ser rotulado é enzimaticamente cortado e um novo nucleotídeo é adicionado ao final exposto de 3′. A atividade da polimerase de DNA I adiciona um nucleotídeo rotulado resultando na sonda desejada^15,16. A técnica de DNA ramificada envolve sondas oligonucleotídeos que hibridizam em pares para alvos de RNA e essas sondas são amplificadas utilizando múltiplas moléculas de amplificação de sinal. Este método pode melhorar significativamente a relação sinal-ruído, mas a amplificação pode distorcer a quantitação precisa, uma vez que as manchas fluorescentes podem ser extremamente diferentes em tamanho e intensidade¹⁷.

Como um sistema modelo para este protocolo, que é totalmente empregado como parte da participação do Programa de Pesquisa de Superfundo niehs para quantificar os efeitos de produtos químicos endócrinos disruptivos em Galveston Bay/Houston Ship Channel, usamos o receptor de estrogênio (ER) linha de células de câncer de mama positiva MCF-7 tratada durante a noite com um agonista ER, 17β-estradiol (E2)^7,18,19. O E2 regula muitos genes alvos de ER, incluindo o gene prototípico alvo de ER, GREB1^7,20,21,22. O protocolo smFISH descrito aqui utiliza um conjunto de dois conjuntos de sondas espectralmente separados visando o GREB1; um que hibridize para exons e o outro para introns, permitindo a medição tanto do RNA maduro quanto nascente⁷. Em seguida, usamos microscopia de epifluorescência juntamente com a desconvolução para amostras rotuladas por SmFISH de imagem e, em seguida, aplicamos rotinas de análise de imagem para quantificar o número de alelos ativos e RNAs maduros por célula.