単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析
Summary
この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。
Abstract
遺伝子転写は細胞生物学に不可欠なプロセスであり、細胞が内部および外部の手掛かりを解釈して応答することを可能にします。mRNA レベルを測定する従来のバルク集団法(ノーザンブロット、PCR、およびRNAseq)は、応答の細胞間変動に関する情報を提供する能力を欠いています。精密な単一細胞およびアレスリックな視覚化および定量は、単一分子RNA蛍光を使用して、その場合のハイブリダイゼーション(smFISH)で可能です。RNA-FISHは、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて標的RNAをハイブリダイズすることによって行われる。これらは中/高スループットのモダリティで画像化することができ、画像解析パイプラインを通じて、成熟したRNAと新生のRNAの両方に関する定量的なデータを単一のセルレベルで提供します。固定、パーメアビライゼーション、ハイブリダイゼーション、イメージングのステップは、ここに記載されているモデルシステムを使用して長年にわたって実験室で最適化されており、smFISH標識の単一細胞分析が成功し、堅牢になります。サンプルの準備と処理の主な目的は、信号対雑音比が高く、誤検出を低減し、より正確なデータを提供する高品質の画像を生成することです。ここでは、サンプルの準備からデータ分析までのパイプラインを、特定のサンプルに合わせて調整するための提案と最適化手順と組み合わせて説明するプロトコルを紹介します。
Introduction
遺伝子の転写と翻訳は、DNA配列からRNA、タンパク質1に移り、生物学の中心的な教義に関与する2つの主要なプロセスです。本研究では、転写中のメッセンジャーRNA(mRNA)の産生に焦点を当てます。新生RNA分子には、非コードイントロンとコーディングエキソンの両方が含まれます。イントロンは、mRNAが細胞質に移動してリボソーム2,3に翻訳する前に共転写される。
従来、mRNAの測定は、RT-qPCRまたはノーザンブロッティングなどの古典的なアッセイを用いて細胞のバルク集団(数百〜数百万)で行われます。非常に強力であるが、これらの方法は、細胞間変動(表現型ヘテロジェネリティ)、転写活性対立遺伝子の数の同定、そしておそらくより重要なことに、空間情報を欠いているという洞察を提供しないことから、限定的である。最近では、単一細胞RNAシーケンシング(RNAseq)を可能にするゲノムワイド技術は、イメージング法とシーケンシング4との間のギャップを埋め始めた。しかし、RNAseqは比較的低い検出効率に苦しんでおり、処理手順は空間情報5を完全に失う結果となる。単一細胞RNAEqは、同一性細胞の集団の中で表現型ヘテロジニアリティに関する洞察を提供することができるが、その現場でのRNA蛍光(RNA-FISH)は、空間レベルでの標的遺伝子発現のより完全な探索を促進し、かつアレル単位6,7に基づく。
RNA FISHは、固定細胞内の標的RNA分子の検出と局在化を可能にする技術です。従来とは異なり、骨状の方法、現在の最先端のRNA-FISHは、標的RNA配列と相補的である市販の核酸プローブを利用し、これらのプローブはWatson-Crick塩基対合体8によってそれらの標的にハイブリダイズする。初期のシチュハイブリダイゼーション技術は、1969年にGallとPardueによって確立された同様のプロトコルを含み、サンプルとして標的RNA9に特異的にハイブリダイズした核酸プローブで処理された。もともとアッセイは放射性または色分け検出を使用して行われました。しかし、1980年代には、DNA FISHおよび後のRNA FISHへの蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)プロトコルの開発は、より敏感な検出への経路を開き、10,11を多重化する可能性を秘めている。
RNA FISHのさらなる発展は、単一RNA分子(smFISH)12,13を検出し定量する能力をもたれている。直接検出は、プローブ自体がフルオロフォアで標識される方法です。smFISHの課題は、蛍光シグナルを明確で回折制限されたスポットとして検出するのに十分なハイブリダイジングプローブ/ターゲットが必要な点です。この問題に対処するために、1つは、標的RNA8、12、14の様々な領域に相補的な短い一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのプローブセットを使用することができる。複数のプローブの結合は、局所的な蛍光色素密度を増加させ、蛍光顕微鏡による明確で高強度のスポットとしてRNAを可視化します。この方法は、プローブセットプール内のオリゴヌクレオチドのオフターゲット結合は、真のシグナルとスプリアスオリゴヌクレオチド結合を区別するためにスポットサイズと強度を定量的に解析することによって真のRNAスポットシグナルと区別できるため有利であり、したがって偽陽性12を低減することによってより正確な分析を促進する。
mRNAを検出する代替方法は、古典的なBACクローンベースのニック翻訳法と、最近開発された分岐DNAシステムです。BACクローンのニック翻訳法では、標識されるDNAは酵素的にニックされ、新しいヌクレオチドが露出した3’末端に追加されます。DNAポリメラーゼIの活性は、所望のプローブ15,16に至る標識ヌクレオチドを付加する。分岐DNA技術は、RNA標的と対にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含み、これらのプローブは複数のシグナル増幅分子を利用して増幅される。この方法は、信号対雑音比を大幅に改善することができますが、蛍光スポットは大きく異なるサイズと強度17であるため、増幅は正確な定量を歪めることができます。
このプロトコルのモデルシステムとして、ガルベストンベイ/ヒューストンシップチャンネルにおける内分泌破壊化学物質の影響を定量化するためにNIEHSスーパーファンド研究プログラムの参加の一環として完全に採用され、エストロゲン受容体(ER)陽性乳癌細胞株MCF-7をERアゴニスト、17β-エストラジオール(E2)7,18,19で一晩投与した。E2は、原型的なER標的遺伝子を含む多くのER標的遺伝子を調節する、GREB17、20、21、22。ここで説明する smFISH プロトコルは、GREB1 を対象とする 2 つのスペクトル分離プローブ セットのセットを使用します。エキソンにハイブリダイズする1つとイントロンに他の1つを、成熟したRNAと新生RNA7の両方の測定を可能にする。次に、画像smFISH標識サンプルにデコンボリューションと相まって蛍光顕微鏡を使用し、画像分析ルーチンを適用して細胞当たりの活性対立胞および成熟RNAの数を定量化する。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されている smFISH の方法論は、以前に公開されたプロトコル7、12、14に基づいています。このプロトコルでは、ウェットラボ(播種密度、固定時間、透過性、プローブ濃度を含む)からイメージングおよび画像解析に最適化された重要なステップを説明し、遺伝子転写の単一細胞分析を行うことに興味を持つ研究所に完全…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MAM、FS、MGMはNIEHS(プロジェクト4、P42ES027704、PI、ルシン)によって資金提供されています。MAM、FS、RMM、MGM、PKSは、CPRITが資金を提供するGCC先端顕微鏡・画像情報学センター(RP170719)によってサポートされています。イメージングは、NIH(DK56338、CA125123)、CPRIT(RP150578)、ダン・L・ダンカン総合がんセンター、ジョン・S・ダン・ガルフ・コースト化学ゲノミクス・コンソーシアムからの資金提供を受けて、ベイラー医科大学の統合顕微鏡コアによってもサポートされています。
Materials
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
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