ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH
Summary
פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.
Abstract
שעתוק גנים הוא תהליך חיוני בביולוגיה של התא, ומאפשר לתאים לפרש ולהגיב לרמזים פנימיים וחיצוניים. שיטות אוכלוסיה בתפזורת מסורתיות (כתם צפוני, PCR ו- RNAseq) המודדות רמות mRNA חסרות את היכולת לספק מידע על שונות בין תאים לתא בתגובות. הדמיה וכימות מדויקים של תא בודד ואלילי אפשריים באמצעות פלואורסצנטיות RNA של מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH). RNA-FISH מבוצע על ידי הכלאת RNAs היעד עם תוויות אוליגונוקלאוטיד בדיקות. אלה יכולים להיות התמונה באומדים תפוקה בינונית / גבוהה, ובאמצעות צינורות ניתוח תמונה, לספק נתונים כמותיים על RNAs בוגרים ומתהווים, כל ברמת תא יחיד. שלבי הקיבעון, ההכלאה, ההכלאה וההדמיה עברו אופטימיזציה במעבדה במשך שנים רבות באמצעות מערכת המודל המתוארת כאן, אשר גורמת לניתוח מוצלח וחזק של תיוג smFISH. המטרה העיקרית עם הכנה ועיבוד מדגם היא לייצר תמונות באיכות גבוהה המאופיינת ביחס אות לרעש גבוה כדי להפחית תוצאות חיוביות שגויות ולספק נתונים מדויקים יותר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר את הצינור מהכנה לדוגמה לניתוח נתונים בשילוב עם הצעות ושלבי מיטוב להתאמה לדגימות ספציפיות.
Introduction
שעתוק ותרגום גנים הם שני התהליכים העיקריים המעורבים בדוגמה המרכזית של הביולוגיה, עוברים מרצף ה- DNA ל- RNA לחלבון1. במחקר זה, אנו מתמקדים בייצור של RNA שליח (mRNA) במהלך שעתוק. מולקולת הרנ”א המתהווה כוללת הן אינטרונים שאינם קידוד והן אקסונים קידוד. אינטרונים הם שותפים תמלול החוצה לפני mRNA עובר לתוך הציטופלסמה לתרגום על ריבוזומים2,3.
באופן מסורתי, המדידה של mRNA מבוצעת באוכלוסיות בתפזורת של תאים (מאות עד מיליונים) עם התקפות קלאסיות כגון RT-qPCR או סופג צפוני. בעוד חזק מאוד, שיטות אלה מוגבלות כפי שהם אינם מספקים תובנות על וריאציה תא לתא (הטרוגניות פנוטיפית), זיהוי של מספר אללים פעילים תמלול, ואולי חשוב מכך, חסר מידע מרחבי. לאחרונה, טכנולוגיות גנום רחב המאפשר ריצוף RNA תא יחיד (RNAseq) החלו לגשר על הפער בין שיטות הדמיה רצף4. עם זאת, RNAseq סובלת מיעילות זיהוי נמוכה יחסית ושלבי העיבוד גורמים לאובדן מוחלט של מידע מרחבי5. למרות שתא יחיד RNAseq יכול לספק תובנות על הטרוגניות פנוטיפית בקרב אוכלוסייה של תאים איזוגניים, פלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (RNA-FISH) יכולה להקל על חקירה מלאה יותר של ביטוי גן היעד ברמה המרחבית, ועל בסיס אלל-על-אלל6,7.
RNA FISH היא טכניקה המאפשרת זיהוי ולוקליזציה של מולקולות RNA היעד בתאים קבועים. שלא כמו שיטות קודמות, מייגעות, RNA-FISH החדיש הנוכחי משתמש בבדיקות חומצת גרעין זמינות מסחרית המשלימות את רצפי הרנ”א היעד, וגשושיות אלה הכלאה ליעדים שלהם על ידי ווטסון-קריק בסיס זיווג8. טכניקות ההכלאה המוקדמות של מקום כללו פרוטוקול דומה שנקבע על ידי גאל ופרדו בשנת 1969, כאשר מדגם עובד עם בדיקות חומצת גרעין שהיברידיות במיוחד ליעד RNA9. במקור, ההסתה בוצעה באמצעות זיהוי רדיואקטיבי או צבעוני; עם זאת, בשנות השמונים, התפתחות הפלואורסצנטיות בפרוטוקולי הכלאה במקום (FISH) לדגי DNA ומאוחר יותר RNA FISH פתחו את המסלול לגילוי רגיש יותר, ואת הפוטנציאל למולטיפלקס10,11.
התפתחויות נוספות ב- RNA FISH הובילו ליכולת לזהות ולכומת מולקולות RNA בודדות (smFISH)12,13. זיהוי ישיר הוא שיטה שבה הבדיקות עצמן מסומנות בפלואורופורים. אתגר עם smFISH הוא שיש צורך מספיק הכלאה בדיקות / יעד כדי להקל על זיהוי של אותות פלואורסצנטיים כנקודות ברורות, עקיפה מוגבלת. כדי לטפל בבעיה זו, ניתן להשתמש בערכת בדיקה של אוליגונוקלאוטידים קצרים חד-גדיליים של DNA המשלימים לאזורים שונים של היעד RNA8,12,14. כריכת בדיקות מרובות מגבירה את צפיפות הפלורופור המקומית, מה שהופך את ה- RNA לגלוי כנקודה נפרדת בעוצמה גבוהה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו היא יתרון כי כריכת מחוץ למטרה של אוליגונוקלאוטידים במאגר ערכת הבדיקה ניתן להבחין בין אות נקודת RNA האמיתי על ידי ניתוח כמותי של גודל הנקודה ואת עוצמתו כדי להבדיל בין אות אמיתי כריכה אוליגונוקלאוטיד מזויף, ובכך להקל על ניתוח מדויק יותר על ידי הפחתת חיובי שווא12.
שיטות חלופיות לזיהוי mRNA הן שיטת תרגום ניק המבוססת על שיבוט BAC ומערכת ה- DNA המסתעפת שפותחה לאחרונה. בשיטת BAC משובטת, ניק-תרגום, ה- DNA שיש לתייג הוא חתך אנזימטי ונוקלאוטיד חדש מתווסף לקצה 3 ‘חשוף. הפעילות של DNA פולימראז אני מוסיף נוקלאוטיד שכותרתו וכתוצאה מכך הבדיקה הרצויה15,16. טכניקת הדנ”א המסועפת כוללת בדיקות אוליגונוקלאוטידים המות לאיברידיות בזוגות ליעדי RNA והגשושיות הללו מוגברות תוך שימוש במולקולות הגברה מרובות של אותות. שיטה זו יכולה לשפר באופן משמעותי את יחס האות לרעש, אך ההגברה יכולה מוטה כמות מדויקת מכיוון שנקודות פלואורסצנטיות יכולות להיות שונות לחלוטין בגודל ובעוצמה17.
כמערכת מודל לפרוטוקול זה, אשר מועסק באופן מלא כחלק מתוכנית המחקר Superfund NIEHS כדי לכמת את ההשפעות של כימיקלים שיבוש אנדוקריני במפרץ גלווסטון / ערוץ הספינה יוסטון, השתמשנו קולטן אסטרוגן (ER) קו תא סרטן שד חיובי MCF-7 שטופלו בן לילה עם אגוניסט ER, 17β-אסטרדיול (E2)7,18,19. E2 מווסת גנים רבים יעד ER, כולל הגן אב טיפוס יעד ER, GREB17,20,21,22. פרוטוקול SmFISH המתואר כאן משתמש קבוצה של שתי ערכות בדיקה מופרדות ספקטרלית המתמקדות GREB1; אחד כי הכלאה אקסונס והשני introns, המאפשר את המדידה של RNA בוגר ומתהווה7. לאחר מכן אנו משתמשים במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית בשילוב עם דה-אבולציה לדגימות עם תווית SmFISH תמונה, ולאחר מכן מיישמים שגרות ניתוח תמונה כדי לכמת את מספר אללים פעילים ו- RNAs בוגרים לתא.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתודולוגיית smFISH המתוארת מבוססת על פרוטוקולים שפורסמו בעבר7,12,14. בפרוטוקול זה, אנו מסבירים את הצעדים הקריטיים שהותאמו מהמעבדה הרטובה (כולל צפיפות זריעה, זמן קיבעון, חדור וריכוז בדיקה), להדמיה וניתוח תמונה, ומספקים צינור ניסיוני מלא למעבדות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MAM, FS ו- MGM ממומנים על ידי NIEHS (פרויקט 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM ו- PKS נתמכים על ידי מרכז GCC במימון CPRIT למיקרוסקופיה מתקדמת ו- Image Informatics (RP170719). הדמיה נתמכת גם על ידי הליבה מיקרוסקופית משולבת במכללת ביילור לרפואה במימון NIH (DK56338, ו CA125123), CPRIT (RP150578), מרכז הסרטן המקיף דן ל דאנקן, וקונסורציום חוף המפרץ ג’ון ס דאן לגנומיקה כימית.
Materials
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
References
- Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).
- Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
- Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
- Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
- Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
- Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
- Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
- Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
- Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
- Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
- Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
- Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
- Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
- Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
- Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
- Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
- Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
- Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
- Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
- Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
- Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
- Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
- Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
- Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
- Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
- Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
- Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
- Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).
