Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gentranskription und -translation sind die beiden Hauptprozesse, die am zentralen Dogma der Biologie beteiligt sind und von der DNA-Sequenz über RNA bis hin zu Protein¹reichen. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Produktion von Boten-RNA (mRNA) während der Transkription. Das entstehende RNA-Molekül umfasst sowohl nicht-kodierende Introns als auch kodierende Exons. Introns werden co-transkriptionell ausgespleißt, bevor sich die mRNA zur Translation auf die Ribosomen^2,3in das Zytoplasma bewegt.

Traditionell wird die Messung von mRNA in Massenpopulationen von Zellen (Hunderte bis Millionen) mit klassischen Assays wie RT-qPCR oder Northern Blotting durchgeführt. Obwohl diese Methoden sehr leistungsfähig sind, sind sie begrenzt, da sie keine Einblicke in die Zell-zu-Zell-Variation (phänotypische Heterogenität), die Identifizierung der Anzahl der transkriptionell aktiven Allele und, was vielleicht noch wichtiger ist, den Mangel an räumlichen Informationen liefern. In jüngerer Zeit begannen genomweite Technologien, die eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung (RNAseq) ermöglichen, die Lücke zwischen bildgebenden Verfahren und Sequenzierung zu schließen⁴. RNAseq leidet jedoch unter relativ geringen Erkennungseffizienzen und die Verarbeitungsschritte führen zum vollständigen Verlust räumlicher Informationen⁵. Obwohl Einzelzell-RNAseq Einblicke in die phänotypische Heterogenität einer Population isogener Zellen liefern kann, kann die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) eine vollständigere Untersuchung der Zielgenexpression auf räumlicher Ebene und auf Allel-für-Allel-Basis ermöglichen^6,7.

RNA FISH ist eine Technik, die den Nachweis und die Lokalisierung von Ziel-RNA-Molekülen in festen Zellen ermöglicht. Im Gegensatz zu früheren, mühsamen Methoden verwendet das derzeit hochmoderne RNA-FISH kommerziell verfügbare Nukleinsäuresonden, die die Ziel-RNA-Sequenzen ergänzen, und diese Sonden hybridisieren durch Watson-Crick-Basenpaarung⁸zu ihren Zielen. Die frühen In-situ-Hybridisierungstechniken beinhalteten ein ähnliches Protokoll, das 1969 von Gall und Pardue festgelegt wurde, als eine Probe mit Nukleinsäuresonden verarbeitet wurde, die spezifisch zu einer Ziel-RNA⁹hybridisiert wurden. Ursprünglich wurde der Assay mittels radioaktiver oder kolorimetrischer Detektion durchgeführt; In den 1980er Jahren eröffnete jedoch die Entwicklung von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsprotokollen (FISH) zu DNA FISH und später RNA FISH den Weg zu empfindlicheren Nachweisen und das Potenzial für multiplexing^10,11.

Weiterentwicklungen in RNA FISH haben dazu geführt, dass einzelne RNA-Moleküle (smFISH) nachgewiesen und quantifiziert werden^{können 12,13}. Der direkte Nachweis ist eine Methode, bei der die Sonden selbst mit Fluorophoren markiert werden. Eine Herausforderung bei smFISH besteht darin, dass genügend hybridisierende Sonden/ Target benötigt werden, um die Detektion von fluoreszierenden Signalen als ausgeprägte, beugungsbegrenzte Flecken zu erleichtern. Um dieses Problem zu lösen, kann man einen Sondensatz von kurzen einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden verwenden, die sich komplementär zu verschiedenen Regionen der Ziel-RNA^8,12,14ergänzen. Die Bindung mehrerer Sonden erhöht die lokale Fluorophordichte, wodurch die RNA durch Fluoreszenzmikroskopie als eigenständiger, hochintensiver Spot sichtbar wird. Diese Methode ist vorteilhaft, da die Off-Target-Bindung von Oligonukleotiden im Sondensatzpool vom echten RNA-Spot-Signal unterschieden werden kann, indem die Spotgröße und -intensität quantitativ analysiert wird, um zwischen echter Signal- und falscher Oligonukleotidbindung zu unterscheiden, wodurch eine genauere Analyse durch Reduzierung von Fehlalarmen ermöglicht wird¹².

Alternative Methoden zum Nachweis von mRNA sind die klassische BAC-klonbasierte Nick-Translation-Methode und das neu entwickelte verzweigte DNA-System. Bei der BAC-geklonten Nick-Translation-Methode wird die zu kennzeichnende DNA enzymatisch genickt und dem exponierten 3′-Ende wird ein neues Nukleotid hinzugefügt. Die Aktivität der DNA-Polymerase I fügt ein markiertes Nukleotid hinzu, was zu der gewünschten^{Sonde 15,16}führt. Die verzweigte DNA-Technik beinhaltet Oligonukleotidsonden, die paarweise zu RNA-Zielen hybridisieren, und diese Sonden werden unter Verwendung mehrerer Signalverstärkungsmoleküle amplifiziert. Diese Methode kann das Signal-Rausch-Verhältnis erheblich verbessern, aber die Verstärkung kann die genaue Quantifizierung verzerren, da fluoreszierende Flecken in Größe und Intensität stark unterschiedlich sein können¹⁷.

Als Modellsystem für dieses Protokoll, das im Rahmen des NIEHS Superfund Research Program voll eingesetzt wird, um die Auswirkungen endokrin wirksamer Chemikalien in Galveston Bay / Houston Ship Channel zu quantifizieren, verwendeten wir die Östrogenrezeptor (ER) positive Brustkrebszelllinie MCF-7, die über Nacht mit einem ER-Agonisten, 17β-Estradiol (E2)^7,18,19behandelt wurde. E2 reguliert viele ER-Target-Gene, darunter das prototypische ER-Target-Gen GREB1^7,20,21,22. Das hier beschriebene smFISH-Protokoll verwendet einen Satz von zwei spektral getrennten Sondensätzen, die auf GREB1 abzielen; eine, die zu Exons und die andere zu Introns hybridisiert, was die Messung sowohl von reifer als auch von naszierender RNA⁷ermöglicht. Wir verwenden dann Epifluoreszenzmikroskopie in Verbindung mit Dekonvolution, um smFISH-markierte Proben abbilden, und wenden dann Bildanalyseroutinen an, um die Anzahl der aktiven Allele und reifen RNAs pro Zelle zu quantifizieren.