Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon
Summary
Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.
Abstract
Elektroporasyon, işlevlerini anlamak için belirli genleri hücrelere aktarmak için kritik bir yöntem olarak kendini belirlemiştir. Burada, fare organotipik hipokampal dilim kültüründe uyarıcı ve sınıfa özgü inhibitör nöronlarda in vitro gen transfeksiyonunun verimliliğini (~%80) en üst düzeye çıkaran tek hücreli bir elektroporasyon tekniğini açıklıyoruz. Büyük cam elektrotlar, tetrodotoksin içeren yapay beyin omurilik sıvısı ve hafif elektriksel darbeler kullanarak, kültürlü hipokampal CA1 piramidal nöronlarına ve inhibitör internöronlara ilgi çekici bir gen sunduk. Ayrıca, elektroporasyon, transfeksiyon verimliliğinde herhangi bir azalma olmadan 21 güne kadar kültürlü hipokampal dilimlerde gerçekleştirilebilir ve farklı dilim kültürü gelişim aşamalarının incelenmesine olanak sağlar. Çeşitli hücre tiplerinde genlerin moleküler fonksiyonlarını incelemeye olan ilgi artarken, yöntemimiz fare beyin dokusunda mevcut elektrofizyoloji ekipmanı ve teknikleri ile gerçekleştirilebilen in vitro gen transfeksiyonunda güvenilir ve basit bir yaklaşım göstermektedir.
Introduction
Moleküler biyolojide, bir araştırmacının en önemli hususlarından biri, işlevini ortaya çıkarmak için bir hücreye veya hücre popülasyonuna ilgi çekici bir genin nasıl teslimılacağıdır. Farklı teslimat yöntemleri biyolojik (örneğin, viral bir vektör), kimyasal (örneğin, kalsiyum fosfat veya lipit) veya fiziksel (örneğin, elektroporasyon, mikroenjeksiyon veya biyoliztik) olarak kategorize edilebilir1,2. Biyolojik yöntemler oldukça verimlidir ve hücre tipine özgü olabilir, ancak spesifik genetik araçların geliştirilmesi ile sınırlıdır. Kimyasal yaklaşımlar çok güçlü in vitrodur, ancak transeksiyonlar genellikle rastgeledir; ayrıca, bu yaklaşımlar çoğunlukla yalnızca birincil hücreler için ayrılmıştır. Fiziksel yaklaşımlar arasında biyolistik teknik açıdan en basit ve en kolay olanıdır, ancak yine nispeten düşük verimlilikte rastgele transfeksiyon sonuçları üretir. Genetik araçlar geliştirmeye gerek kalmadan belirli hücrelere transfer gerektiren uygulamalar için, tek hücreli elektroporasyon3,4‘e bakıyoruz.
Elektroporasyon sadece alan elektroporasyonunu ifade etmek için kullanılırken, son yirmi yıl içinde, özgüllüğü ve verimliliği artırmak için çoklu in vitro ve in vivo tek hücreli elektroporasyon protokolleri geliştirilmiştir5,6,7, elektroporasyonun genleri tek tek hücrelere aktarmak için kullanılabileceğini ve bu nedenle son derece hassas olabileceğini göstermiştir. Ancak, prosedürler teknik olarak zorlu, zaman alıcı ve nispeten verimsizdir. Gerçekten de, daha yeni makaleler mekanize elektroporasyon makinelerinin fizibilitesini araştırdı8,9, bu tür robotikleri kurmakla ilgilenen araştırmacılar için bu engellerin birkaçını ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir. Ancak daha basit araçlar arayanlar için, elektroporasyon, yani hücre ölümü, transfeksiyon yetmezliği ve pipet tıkanması ile ilgili sorunlar bir endişe olmaya devam ediyor.
Son zamanlarda daha büyük uçlu cam pipetler kullanan bir elektroporasyon yöntemi geliştirdik, daha hafif elektriksel darbe parametreleri ve eksistik nöronlarda önceki yöntemlere göre çok daha yüksek transfeksiyon verimliliği sağlayan ve ilk kez fare organotipik dilim kültürünün hipokampal CA1 bölgesindeki somatostatin ekspresyon inhibitör internöronlar da dahil olmak üzere inhibitör internöronlardaki genleri dönüştürmemizi sağlayan benzersiz bir basınç döngüsü adımı10. Ancak bu elektroporasyon yönteminin farklı inhibitör internöron tiplerinde ve nöronal gelişim evrelerinde güvenilirliği ele alınmamıştır. Burada, bu elektroporasyon tekniğinin genleri hem uyarıcı nöronlara hem de farklı internöron sınıflarına aktarabildiğini gösterdik. Daha da önemlisi, test edilen in vitro (DIV) dilim kültürü yaşı ne olursa olsun transfeksiyon verimliliği yüksekti. Bu yerleşik ve kullanıcı dostu teknik, in vitro fare beyin dokusu bağlamında farklı hücre tipleri için tek hücreli elektroporasyon kullanmak isteyen herhangi bir araştırmacıya şiddetle tavsiye edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada hem uyarıcı hem de inhibitör nöronları yüksek verimlilik ve hassasiyetle transfect eden bir elektroporasyon yöntemini tarif ediyoruz. Optimize edilmiş elektroporasyon protokolümüz, yüksek verimli gen transfeksiyonunu elde etmek için üç yenilikçi atılım gerçekleştirmektedir. İlk modifikasyonumuz pipet boyutunu daha önce yayınlananprotokollerekıyasla artırmaktı 3,5,6. Bu değişiklik, pipet tıkanma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibe Enstitüleri (R01NS085215 ila K.F., T32 GM107000 ve F30MH122146 ila A.C. ) tarafından desteklendi. Yazarlar, Bayan Naoe Watanabe’ye yetenekli teknik yardım için teşekkür ediyorlar.
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).
