Одноклеточная электропорация по различным органотипическим культурам срезов возбуждающих и специфических для класса тормозных нейронов гиппокампа мыши

В молекулярной биологии одним из наиболее важных соображений для исследователя является то, как доставить ген, представляющий интерес, в клетку или популяцию клеток, чтобы прояснить его функцию. Различные способы доставки могут быть классифицированы как биологические (например, вирусный вектор), химические (например, фосфат кальция или липиды) или физические (например, электропорация, микроинъекция или биолистика)1,^2. Биологические методы очень эффективны и могут быть специфичными для типа клеток, но ограничены разработкой конкретных генетических инструментов. Химические подходы очень сильны in vitro, но трансфекции, как правило, случайны; кроме того, эти подходы в основном зарезервированы только для первичных клеток. Из физических подходов биолистика является самой простой и легкой с технической точки зрения, но опять же дает случайные результаты трансфекции при относительно низкой эффективности. Для применений, которые требуют переноса в конкретные клетки без необходимости разработки генетических инструментов, мы смотрим на одноклеточную электропорацию^3,4.

В то время как электропорация раньше относится только к полевой электропорации, за последние двадцать лет были разработаны множественные протоколы электропорации in vitro и in vivo с одной ячейкой для повышения специфичности и эффективности^5,6,7,демонстрируя, что электропорация может использоваться для переноса генов в отдельные клетки и, следовательно, может быть чрезвычайно точной. Однако процедуры технически сложны, трудоемки и относительно неэффективны. Действительно, более поздние работы исследовали целесообразность механизированных электропорационных установок^8,9,которые могут помочь устранить некоторые из этих барьеров для исследователей, заинтересованных в установке такой робототехники. Но для тех, кто ищет более простые средства, проблемы с электропорацией, а именно гибель клеток, отказ трансфекции и засорение пипетки, остаются проблемой.

Недавно мы разработали метод электропорации, который использует стеклянные пипетки с большим наконечником, более мягкие параметры электрического импульса и уникальный этап циклического давления, который генерировал гораздо более высокую эффективность трансфекции в возбуждающих нейронах, чем предыдущие методы, и позволил нам впервые трансфектировать гены в ингибирующих интернейронах, включая соматостатин-экспрессирующие ингибирующие интернейроны в области гиппокампа CA1 органотипической культуры срезов мыши^10. Однако надежность этого метода электропорации в различных ингибирующих типах интернейронов и стадиях развития нейронов не была рассмотрена. Здесь мы продемонстрировали, что этот метод электропорации способен трансфектировать гены как в возбуждающие нейроны, так и в различные классы интернейронов. Важно отметить, что эффективность трансфекции была высокой независимо от дней in vitro (DIV) среза культуры, проверенных возрастом. Этот установленный и удобный для пользователя метод настоятельно рекомендуется любому исследователю, заинтересованному в использовании одноклеточной электропорации для различных типов клеток в контексте ткани мозга мыши in vitro.