Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

In der Molekularbiologie ist eine der wichtigsten Überlegungen für einen Forscher, wie man ein Gen von Interesse in eine Zelle oder Zellpopulation liefert, um seine Funktion aufzuklären. Die verschiedenen Verabreichungsmethoden können entweder als biologisch (z. B. ein viraler Vektor), chemisch (z. B. Calciumphosphat oder Lipid) oder physikalisch (z. B. Elektroporation, Mikroinjektion oder Biolistik)^1,2kategorisiert werden. Biologische Methoden sind hocheffizient und können zelltypspezifisch sein, sind aber durch die Entwicklung spezifischer genetischer Werkzeuge begrenzt. Chemische Ansätze sind in vitro sehr leistungsfähig, aber Transfektionen sind im Allgemeinen zufällig; Darüber hinaus sind diese Ansätze meist nur Primärzellen vorbehalten. Von den physikalischen Ansätzen ist die Biolistik aus technischer Sicht die einfachste und einfachste, produziert aber wiederum zufällige Transfektionsergebnisse mit einer relativ geringen Effizienz. Für Anwendungen, die den Transfer in bestimmte Zellen erfordern, ohne dass genetische Werkzeuge entwickelt werden müssen, schauen wir uns die Einzelzellelektroporation^{an 3,4}.

Während sich die Elektroporation früher nur auf die Feldelektroporation bezog, wurden in den letzten zwanzig Jahren mehrere in vitro und in vivo Einzelzellelektroporationsprotokolle entwickelt, um die Spezifität und Effizienz zu verbessern^5,6,7, die zeigen, dass die Elektroporation verwendet werden kann, um Gene auf einzelne Zellen zu übertragen und daher äußerst präzise sein kann. Die Verfahren sind jedoch technisch anspruchsvoll, zeitaufwendig und relativ ineffizient. In der Tat haben neuere Arbeiten die Machbarkeit von mechanisierten Elektroporationsrigs⁸,^9untersucht,die dazu beitragen können, mehrere dieser Barrieren für Forscher zu beseitigen, die an der Installation solcher Robotik interessiert sind. Aber für diejenigen, die nach einfacheren Mitteln suchen, bleiben die Probleme mit der Elektroporation, nämlich Zelltod, Transfektionsversagen und Pipettenverstopfung, ein Problem.

Wir haben kürzlich eine Elektroporationsmethode entwickelt, die größere Glaspipetten, mildere elektrische Pulsparameter und einen einzigartigen Druckzyklusschritt verwendet, der eine viel höhere Transfektionseffizienz in exzitatorischen Neuronen erzeugte als frühere Methoden und es uns zum ersten Mal ermöglichte, Gene in inhibitorischen Interneuronen zu transfizieren, einschließlich somatostatin-exprimierender inhibitorischer Interneuronen in der Hippocampus-CA1-Region der organotypischen Scheibenkultur der Maus¹⁰. Die Zuverlässigkeit dieser Elektroporationsmethode in verschiedenen inhibitorischen Interneurontypen und neuronalen Entwicklungsstadien wurde jedoch nicht untersucht. Hier haben wir gezeigt, dass diese Elektroporationstechnik in der Lage ist, Gene sowohl in exzitatorische Neuronen als auch in verschiedene Klassen von Interneuronen zu transfizieren. Wichtig ist, dass die Transfektionseffizienz unabhängig von den getesteten Tagen in vitro (DIV) Scheibenkultur hoch war. Diese etablierte und benutzerfreundliche Technik wird jedem Forscher empfohlen, der daran interessiert ist, die Einzelzellelektroporation für verschiedene Zelltypen im Zusammenhang mit In-vitro-Mausgehirngewebe zu verwenden.