Visualização bidimensional e quantificação de labile, nutrientes vegetais inorgânicos e contaminantes no solo

1. Fabricação de géis DGT NOTA: Vários tipos de gel DGT estão disponíveis para imagens 2D de espécies de súto labile em alta resolução espacial (submm)35. Aqui, a fabricação de três géis de ligação de alta resolução (HR)-DGT bem caracterizados usados em aplicações de imagem soluto é brevemente resumida. Procedimentos laboratoriais para análise de elementos de rastreamento, bem como procedimentos detalhados de fabricação de todos os géis HR-DGT apresentados estão descritos nas seções de Informações de Suporte (SI) S1 e S2. ânion misto à base de poluretano e gel de ligação de cáção (HR-MBG; SI S2.1)31 Prepare uma suspensão de gel de poliuretano com fases de cloróxido de zircônio (IV) e iminodiacetato (IDA) homogeneamente dispersos. Cubra a suspensão do gel em uma película fina em uma placa de vidro e inicie a formação de gel por evaporação de solvente para obter um ânion misto de 0,1 mm fino, à prova de lágrimas e gel de ligação de cátion (HR-MBG). Gel de ligação de ânion poliacrilamida-zirconia (HR-ABG; SI S2.2)36 Fabricar um gel de poliacrilamida transversal (APA) de 0,4 mm de espessura, seguindo os procedimentos estabelecidos de fundição de gel37 (ver SI S2.4 para um protocolo detalhado da fabricação da APA). Precipitar fases de hidróxido de zircônio (IV) no gel APA pré-moldado para obter um gel de ligação de ânion de 0,4 mm de espessura (HR-ABG). Poliacrilamida-iminodiacetato gel de ligação de cation (HR-CBG; SI S2.3)38 Prepare uma suspensão de gel de poliacrilamida com fases IDA dispersas homogêneas. Lance o gel entre duas placas de vidro e inicie a reação de polimerização para obter um gel de ligação de cáção fino de 0,4 mm (HR-CBG) onde as fases IDA são instaladas em um lado do gel. 2. Cultivo de plantas NOTA: O sistema experimental usa rizotrons4 (Figura 1) para cultivar plantas em solo insaturado para imagem de soluto. Primeiro, o enchimento e rega do solo rizotron são descritos, em seguida, detalhes sobre o crescimento experimental da planta são dados. Detalhes sobre o design do rizotron e a preparação do substrato do solo antes de encher o rizotron são apresentados na seção SI S3. Figura 1: Design de rizotron (não para escalar). (A) Visão explodida de um recipiente de crescimento de rizotron. (B) Rizotron montado durante o crescimento da planta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Enchimento do solo de rizotronAntes de encher o rizotron com solo pré-umedecido (teor de água gravimétrica, é conhecido; ver SI S3.2), feche os orifícios de rega na parte de trás do rizotron usando fita adesiva e remova a placa frontal e seus trilhos de fixação e parafusos. Pesar o rizotron vazio (excluindo a placa dianteira, trilhos e parafusos), oito placas de acrílico de 5 cm x 11 cm e 16 grampos(Tabela de Materiais) e registrar a soma dos pesos. Coloque uma pequena placa de acrílico na parte inferior do rizotron usando dois grampos de cada lado, com a pressão dos grampos direcionados para o quadro rizotron, para que a placa não se dobre para dentro e o volume seja constante. Incline o rizotron ligeiramente em direção à pequena placa de plástico e encha com solo pré-umedecido até uma altura de ~4 cm(Figura 2A). Distribua o solo dentro do rizotron agitando o rizotron ligeiramente e gentilmente comprimindo o solo por alguns mm (dependendo das características específicas do solo) com uma ferramenta de compactação(Figura 2B). Repita 2.1.3 – 2.1.4 até que o rizotron esteja cheio de solo(Figura 2C). Deixe uma lacuna de ~3 cm na parte superior para o plantio subsequente de mudas no rizotron. Pesar o rizotron cheio de solo (incluindo 8 placas pequenas e 16 grampos) e registrar o peso. A partir disso, subtraia o peso rizotron vazio obtido em 2.1.2 e registra a diferença de peso, ou seja, a massa de solo úmido, (g), no rizotron. Calcule a massa de solo seco no rizotron, (g), de acordo com Eq. 1, e calcule a densidade a granel seca do solo, (g cm-3), no rizotron segundo Eq. 2.Aqui, (cm3) é o volume interno total do rizotron.NOTA: Os valores típicos no rizotron estão entre 1,0-1,4 g cm-3. Não exceda 1,5 g cm-3, pois o crescimento da raiz pode ser impedido acima desse valor. Coloque o rizotron cheio de solo em uma caixa de suporte e remova todos os grampos e pequenas placas do rizotron(Figura 2D). Limpe cuidadosamente a estrutura do rizotron (ou seja, bordas) usando papel de tecido, pois partículas remanescentes do solo na estrutura podem causar vazamentos.NOTA: A superfície exposta do solo deve ser homogênea e nivelada com a estrutura do rizotron sem quaisquer rachaduras ou lacunas. Caso não, esvazie o rizotron e repita 2.1.2 – 2.1.8. Corte duas peças de politetrafluoroetileno (PTFE)(Tabela de Materiais) para 22 cm x 13 cm cada. Além disso, corte um pedaço de papel alumínio para 46 cm x 15 cm. Registo a soma de PTFE e pesos de papel alumínio. Coloque a primeira peça de folha PTFE na metade superior da superfície exposta do solo no rizotron, estendendo-se ~1 cm sobre o nível do solo na parte superior do rizotron. Fixar cuidadosamente a folha PTFE no quadro rizotron usando fita adesiva(Figura 2E). Comece fixando um canto no topo do rizotron primeiro, seguido por seu canto oposto e finalmente os dois cantos mais abaixo do rizotron. Aplique tensão ao fixar os cantos 2-4 para garantir uma superfície de papel alumínio plana. Se as dobras surgirem, abra e rearreje a fita em cantos individuais (nem todos de uma vez) até que todas as dobras sejam removidas e a folha PTFE seja plana e contígua com a superfície do solo. Coloque a segunda peça de folha PTFE na extremidade inferior do rizotron, sobrepondo a peça de folha ptfe superior em ~1 cm. Repita 2.1.10 para fixar a segunda folha PTFE ao rizotron. Coloque a folha de plástico (46 cm x 15 cm) sobre as folhas PTFE. Fixar a folha de plástico usando o procedimento de fixação conforme detalhado em 2.1.10. Coloque uma placa frontal no rizotron cheio de solo e coberto de papel alumínio. Coloque um trilho em torno de cada lado do rizotron e aperte os parafusos à mão para fixar os trilhos e, assim, a placa dianteira para o rizotron. Os parafusos estão posicionados em direção ao lado fechado do rizotron, ou seja, o lado com os orifícios de rega(Figura 1A). Figura 2: Montagem de rizotron e enchimento para cultivar plantas no solo para imagem de soluto na rizosfera. (A)Enchimento do solo no rizotron. (B) Compactação do solo preenchido utilizando uma ferramenta de compactação. (C) Rizotron cheio de solo com pequenas placas de acrílico e grampos. (D) Rizotron cheio de solo com superfície exposta do solo. (E) Rizotron cheio de solo parcialmente coberto com uma folha de PTFE protetora. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Manuseio de rizotron e aplicação de gel DGT. (A) Rega do solo usando pontas de pipeta de 10 mL nos orifícios de rega na parte de trás do rizotron. (B) Plantio de mudas (indicadas como manchas verdes) no rizotron cheio de solo e fechado. (C) Rizotron plantado com estacas Salix smithiana e placa frontal removida e tampa de papel alumínio. (D) Retire cuidadosamente a tampa da folha PTFE antes da aplicação do gel DGT. (E) Foto de alta resolução do ROI interface solo-raiz. (F) Aplicação da placa frontal equipada com o gel DGT sobre o rizotron. (G) Foto do ROI com o gel DGT aplicado durante a amostragem de soluto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Regando o solo Determine a capacidade de retenção de água (WHC) do solo experimental no rizotron. Para isso, fabricar dois rizotrons com fundo aberto e enchê-los com solo conforme especificado na seção 2.1. Saturar totalmente esses rizotrons abertos e cheios de solo por imersão em um recipiente de água por 16 h e drenar os rizotrons por 8h. Pegue uma amostra de solo composto de ~50 g de locais aleatórios nos rizotrons de fundo aberto e seque a amostra a 105 °C para determinar de acordo com Eq. S1. O determinado corresponde ao WHC do solo e é, portanto, expresso como (g-1). Defina o alvo no rizotron experimental. Durante a fase de crescimento, defina um de 60 % do WHC (ou seja, o fator WHC) para fornecer às plantas uma quantidade adequada de água, evitando condições anoxidas no rizotron. Calcule a massa total de água a ser adicionada, (g), para irrigar o solo no rizotron no alvo de acordo com Eq. 3. Conta a massa de água presente no solo no rizotron, (g). Divida pelo número de orifícios de rega de rizotron (aqui 14) para obter a massa de água a ser adicionada em cada orifício de rega. Adicione água empurrando pontas de pipeta de 10 mL para os orifícios de rega e deixando a água fluir para o solo por gravidade(Figura 3A). Crescimento da planta Sementes pré-germinadas da planta experimental (por exemplo, em papel filtro molhado) de acordo com os requisitos específicos de germinação de sementes até que o radículo surja (até 1 cm de comprimento). Plante até duas mudas no rizotron, conforme indicado na Figura 3B. No plantio, adicione ~5 mL de água diretamente às mudas para apoiar seu crescimento. Cubra a abertura superior do rizotron para os primeiros ~dois dias após o plantio com um filme transparente e retendo umidade(Tabela de Materiais). Enrole o rizotron em papel alumínio para evitar o crescimento microfítico.NOTA: Além das mudas, as estacas de plantas também podem ser cultivadas em rizotrons. Transfira o rizotron plantado para uma sala de crescimento, com condições ambientais (ou seja, temperatura, umidade, intensidade de luz) definidas para as exigências específicas da planta. Incline o rizotron a 25°-35° para garantir o desenvolvimento da raiz ao lado da placa frontal via gravitropismo. Durante o crescimento da planta, mantenha gravimetricamente o teor de água alvo no rizotron, regando periodicamente a cada 2-4 dias usando os orifícios de rega de rizotron, conforme detalhado em 2.2.5. Mantenha a superfície do solo na abertura superior úmida por adições regulares de ~5 mL de água.NOTA: Se as plantas forem cultivadas por longos períodos e a biomassa vegetal diminuir substancialmente a quantidade de água adicionada ao rizotron pelo método proposto, responda pelo peso da biomassa vegetal, cultivando plantas em réplicas de rizotron separadas e colhendo e pesando os tecidos vegetais em intervalos definidos. Uma vez que as raízes atinjam um local adequado ao longo da placa frontal, preferencialmente no centro do rizotron, aplique géis DGT para amostragem da distribuição de soluto rizosférico. 3. Amostragem da distribuição soluto Aplicação de gel Aumento do rizotron de 60 % para 80 % 24 h antes da aplicação do gel conforme detalhado em 2.2.4.-2.2.5. Isso garante um bom contato solo-gel e permite a difusão soluto no gel, evitando condições anoxilicas do solo durante a amostragem de soluto. Pegue uma nova placa frontal limpa a ácido, alinhe-a no rizotron usado para amostragem e marque as regiões de interesse (ROIs) na placa. Transfira a placa para um banco de fluxo laminar ou qualquer outro ambiente sem poeira e metal, desmarcado de frente para cima. Corte o gel de ligação DGT em um suporte acrílico ao tamanho retangular necessário correspondente ao ROI, geralmente em torno de 3 cm × 5 cm, usando lâminas de barbear revestidas de PTFE. Corte o gel pressionando ao invés de deslizar a lâmina de barbear para garantir um corte claro. Coloque a peça de gel retangular no lado não marcado da placa no local marcado do ROI.NOTA: Se o HR-MBG for usado, uma folha espaçadora de 100 μm fina pode ser adicionada sob o gel para garantir que o gel esteja em bom contato com o sistema de raiz do solo. Corte uma membrana de policarbonato de 10 μm fina (tamanho de poros de 0,2 μm; Tabela de Materiais) a um tamanho que estende o tamanho do gel em ≥1 cm em cada lado e coloque a membrana sobre o gel. Aplique um pouco de água para remover bolhas de ar da pilha. Fixar a membrana ao longo das quatro bordas usando fita elétrica de vinil(Tabela de Materiais). No processo, remova cuidadosamente as bolhas de ar presas entre o gel e a membrana usando pinças plásticas. A fita só deve entrar em contato com a membrana e não com o gel.NOTA: Se a fita entrar em contato com o gel, as bolhas de ar ficam presas entre o gel e a membrana, ou a superfície final da membrana mostra dobras, a pilha de gel/membrana precisa ser remontada, pois o fluxo difuso de solutos no gel pode ser prejudicado35 (repita 3.1.3 – 3.1.5). Coloque o rizotron em um suporte, retire os trilhos e retire cuidadosamente a placa frontal(Figura 3C). Retire a folha de plástico, corte a folha ptfe nas bordas do rizotron e retire lentamente a folha ptfe para evitar a perturbação do sistema terra-raiz(Figura 3D). Tire uma foto ortogonal do ROI usando uma câmera digital de reflexo de lente única (DSLR)parafacilitar a interpretação e apresentação da distribuição soluto com base na estrutura do solo e morfologia radicular(Figura 3E). Use um suporte de câmera e, se disponível, uma lente macro. Alinhe a câmera para que o centro da foto corresponda ao centro do ROI, e o plano de foco da câmera é paralelo à superfície do solo. Inclua uma barra de escala (por exemplo, uma régua) na foto. Conecte a placa equipada com a pilha de gel/membrana ao rizotron aberto(Figura 3F). Portanto, alinhe uma borda da placa com uma borda do rizotron e gentilmente ‘dobre’ a placa em direção ao solo. Este modo de aplicação ajuda a evitar bolhas de ar entre a pilha de gel/membrana e o sistema de raiz do solo. Fixar a placa frontal usando os trilhos e parafusos.NOTA: Este passo é crítico e precisa ser realizado com cuidado. A placa não pode ser movida após estabelecer contato entre a pilha de gel/membrana e o sistema de raiz do solo sem deslocar o solo e as raízes. Regissua o tempo exato de partida da implantação do gel e tire uma foto do gel implantado no ROI conforme dado em 3.1.7 (Figura 3G). Enrole o rizotron em papel alumínio e transfira para a sala de crescimento até o final do período de amostragem soluto (muitas vezes 24 h). Recuperação de gel Coloque o rizotron em uma caixa de suporte, retire cuidadosamente a placa frontal e enxágue a pilha de gel/membrana na placa com água para lavar partículas de adesão(Figura 4A). Regisso tempo final exato de implantação de gel. Amostra de solo do ROI para determinar osolo wreal no rizotron de acordo com Eq. S1. Transfira a placa frontal para o banco de fluxo laminar, a pilha de gel/membrana virada para cima. Recupere o gel da placa frontal removendo cuidadosamente a fita ao longo de todas as quatro bordas e, em seguida, a membrana de policarbonato que cobre o gel(Figura 4B). Aplique água para ajudar o gel a flutuar livremente em uma fina película de água na placa com o lado de contato do solo voltado para cima.NOTA: É fundamental acompanhar a orientação do gel. O lado do gel exposto ao solo e às raízes deve sempre enfrentar para cima (em direção ao usuário). Secagem de gel Corte um pedaço retangular de papel de gel(Tabela de Materiais)e coloque um pedaço ligeiramente menor de uma membrana polieethersulfone (tamanho de poros de 0,45 μm; Tabela de Materiais) em cima. Transfira o gel da placa para a pilha de papel/membrana de gel borrando usando pinças plásticas, lado do contato do solo voltado para cima. O gel deve ser relaxado (ou seja, não esticado) e completamente plano, sem bolhas de ar entre gel e membrana. Aplique um pouco de água na pilha de papel/membrana de gel para facilitar a transferência e posicionamento do gel. Cubra completamente a pilha de papel/membrana/gel de gel com um pedaço de papel alumínio e rotule a amostra de gel e sua orientação sobre a folha de plástico(Figura 4C). Coloque a pilha de papel/membrana/gel/papel plástico em uma pilha de gel a vácuo(Tabela de Materiais)e seque até que a pilha esteja totalmente dessecada (tipicamente 48-72 h). Para HR-MBG, defina a temperatura para 50-55 °C, para HR-ABG e HR-CBG melhor seca em temperatura ambiente. Remova o papel de gel da pilha seca e transfira o gel, que agora é inseparavelmente fundido com a membrana polieethersulfone, em um saco zip. A tampa de papel alumínio permanece no gel até pouco antes da análise LA-ICP-MS. Inclua uma peça de gel da folha de gel original como um método em branco, que não fica exposto ao solo. Processe o método em gel em branco idêntico ao gel de amostra após 3.3.2 – 3.3.4. Figura 4: Recuperação de gel DGT e preparação para secagem após amostragem de soluto. (A) Placa com o gel DGT e rizotron logo após a amostragem de soluto. (B) Recuperação do gel DGT da placa em um banco de fluxo laminar. (C) Pilha de papel de gel/membrana de polietófone/tampa de gel/papel plástico DGT para secagem de gel. Note que o gel é ligeiramente colorido após sua implantação no solo da rizofera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 4. Análise química do gel de ligação DGT NOTA: Neste protocolo, a análise da distribuição soluto no gel de ligação DGT é realizada pelo LA-ICP-MS utilizando um sistema de excimer LA de 193 nm de nanosegundos de 193 nm equipado com uma célula de ablação de dois volumes acoplada a um quadrupole ICP-MS(Figura 5). Todos os instrumentos estão listados na Tabela de Materiais. Alternativamente, nanossegundos 213 nm ou 266 nm sistemas LA de estado sólido podem ser aplicados36,39,40,41,42,43. Se for necessária uma sensibilidade ou resolução de massa aprimorada, o campo setorial ICP-MS é uma alternativa ao quadrupole ICP-MS15,44. Detalhes sobre a elaboração das normas de gel DGT para calibração externa e acoplamento do sistema LA ao quadrupole ICP-MS são apresentados nas seções SI S4 e S5. Figura 5: Configuração LA-ICP-MS para análise de gel DGT. (A) Nanosegundo 193 nm Sistema de excimer LA ArF e quadrupole ICP-MS. (B) Géis secos montados em placas de vidro e fixados no estágio de amostra de LA prontos para introdução na célula de ablação. (C) Gás nebulizador (Ar) do ICP-MS e gás transportador de aerossol (He ou Ar) da célula de ablação conectada à ICP através de um encaixe de adaptador Y-splitr bidiretivo e tocha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Preparação da amostra para LA-ICP-MS Transfira as amostras de gel seco, os padrões e os espaços em branco do método (que são mesclados com o suporte à membrana poliethersulfone) para pedaços individuais de fita adesiva de dois lados(Tabela de Materiais),do lado do gel voltado para cima. Crop peças de fita em excesso para economizar espaço na célula de ablação. Monte os géis secos em placas de vidro. Use placas de vidro individuais para cada amostra de gel, série padrão ou método em branco para permitir o arranjo flexível no estágio de amostra de LA (tamanho típico de 10 cm × 10 cm). Use um cortador de vidro para ajustar o tamanho da placa de vidro conforme necessário. Fixar as placas de vidro com os géis no estágio da amostra de LA(Figura 5B)utilizando plasticina(Tabela de Materiais). Nivele a superfície do gel ajustando o piso do palco e bloqueie o estágio da amostra na célula de ablação. Análise de varredura de linha LA-ICP-MSAcople o sistema LA ao ICP-MS conforme especificado na seção SI S5. No software LA(Tabela de Materiais),ajuste as configurações de luz da câmera (ou seja, ‘Anel’, ‘Coax’ e ‘Transmitido’) para iluminar a superfície do gel na célula de ablação e se concentre na superfície do gel ajustando a distância do eixo Z. Mova-se para locais aleatórios em toda a célula para garantir que todas as superfícies de gel estejam em foco. Defina os parâmetros de LA na janela ‘Configuração a laser’ do software LA. As configurações típicas utilizadas na análise de varredura de linha LA-ICP-MS dos géis DGT são: modo contínuo; produção de energia 20-30%; taxa de repetição de 10-20 Hz; diâmetro da mancha 100-200 μm; velocidade de varredura 150-250 μm s-1.NOTA: Os parâmetros precisam ser otimizados para o tipo de gel utilizado e podem variar. Os parâmetros também podem ser aprimorados para aumentar a relação sinal/ruído, resolução espacial ou reduzir os tempos de aquisição, dependendo da configuração experimental e instrumental. Use uma produção de energia relativamente baixa (≤40 %) e taxa de repetição (≤25 Hz) para evitar penetrar através dos géis nos materiais de apoio39. Certifique-se de que a velocidade de varredura a laser está ≤ o diâmetro da mancha dividido pela duração total do ciclo de varredura ICP-MS (ver 4.2.6) para evitar a compressão dos pontos de dados e, portanto, uma perda de resolução na direção de varredura45. Por exemplo, ao definir um diâmetro de ponto de 200 μm e uma duração total do ciclo de varredura ICP-MS de 0,25 s, a velocidade de varredura deve ser de ≤800 μm s-1. Selecione a ferramenta de linha e desenhe um padrão de linha de ~1 mm de comprimento através de um padrão de gel. Clique com o botão direito do mouse no padrão de linha na janela ‘Padrões de varredura’ e verifique se os parâmetros de LA definidos em 4.2.3. foram adotados. Use a ferramenta ‘Duplicate Scans’ para duplicar esta linha quatro vezes, com uma distância interline (distância entre o centro da linha) maior que o diâmetro da mancha(Figura 6). Esta abordagem oferece um total de cinco linhas paralelas por padrão gel (n = 5). Repita esta etapa para cada padrão de gel, calibração em branco e método em branco. Mova-se para a amostra de gel e desenhe uma única linha ao longo da borda superior da área retangular a ser analisada. Duplicar a linha para criar linhas paralelas para toda a área de amostra, conforme especificado em 4.2.3. Use uma distância interline de 300-400 μm. Certifique-se de que o foco (distância do eixo z) está definido corretamente para cada ponto inicial e final de cada linha.NOTA: A resolução espacial da análise é maior ao longo da direção de varredura em comparação com a distância interline. Portanto, os pontos de partida e extremidade das linhas podem seguir melhor a direção dos gradientes de analito. Para gradientes de rizofera, este é geralmente perpendicular ao eixo raiz(Figura 6). No software ICP-MS(Tabela de Materiais),configure um método ‘Data Only’ resolvido no método ‘Método’, selecione um ou mais isótopo(s) adequado para cada analito e inclua 13C como padrão de normalização interna31,36,40,41,42. Verifique se a detecção dos isótopos não está prejudicada pelas interferências46. Defina a duração total do ciclo de varredura do método ICP-MS (‘Est. Reading Time’) para ≤0,5 s com tempos de moradia apropriados por isótopo (tipicamente entre 10-50 ms). Defina as leituras ‘leituras’ ICP-MS ‘ para 1 e altere o valor ‘Leituras/Réplica’ para definir o tempo total de medição por amostra (‘Est. Tempo de Amostragem’), ou seja, por linha de ablação individual. Isso depende dos parâmetros específicos de LA e das distâncias de linha definidas em 4.2.2 – 4.2.4. Para relatórios de dados, use um modo de coleta de dados de intensidade versus tempo e defina a ‘Opção de gravação de arquivo’ para ‘ New PerSample’ para criar um arquivo de dados individual (aqui .xl) para cada linha de ablação. Configure uma sequência de amostra ‘Batch’ na tela ICP-MS ‘Sample’, com cada entrada de amostra correspondente a uma linha de ablação individual definida em 4.2.3 – 4.2.4. Clique em ‘Analisar o lote’ para iniciar a sequência de amostra no ICP-MS, que aguardará com a aquisição de dados até que seja acionado pelo primeiro pulso de laser (consulte SI S5 para obter detalhes sobre a configuração do gatilho). No software LA, selecione todas as linhas a serem analisadas e verifique se o método ICP-MS (‘Est. Sampling Time’, ver 4.2.6.) corresponde à duração das ablações de linha individual, que é tipicamente diferente para amostras de gel, padrões e em branco de método. Repita 4.2.6. para ajustar o método ICP-MS, se necessário. Clique em ‘Emissão’ na janela ‘Laser Energy’ para recarregar a cabeça laser e, em seguida, clique em ‘Executar’ para abrir a janela ‘Executar experimento’. Aqui, selecione ‘Padrões Selecionados Apenas’, defina o ‘Atraso de lavagem’ para 20-30 s, marque a caixa ‘Habilitar laser durante varreduras’ e defina o ‘Laser Warmup Time’ para 10 s. Clique em ‘Executar’ na janela ‘Executar experimento’ para iniciar a análise de varredura de linha e monitorar a intensidade bruta do sinal em contagens por segundo (cps) para cada isótopo no ICP-MS em tempo real. Cada linha deve iniciar (‘Laser Warmup Time’, 10 s) e terminar (‘Washout Delay’, 20-30 s) com um gás em branco. Monitore a fluência a laser (J cm-2) durante a análise para avaliar a estabilidade do laser. Se a fluência variar em grande parte, aborte a análise e verifique se a fonte de laser e/ou seu sistema espelho estão totalmente funcionais. Após a análise, pare o plasma ICP-MS e defina a taxa de fluxo de gás transportador no sistema la para 0 mL min-1. Remova os géis da célula de ablação e armazene em sacos zip para uso posterior. Figura 6: Esquema do projeto experimental DGT LA-ICP-MS (não para escalar). A ilustração retrata a amostragem in situ solute baseada em DGT na rizosfera e o mapeamento LA-ICP-MS da distribuição de soluto na superfície do gel, incluindo um close-up mostrando dimensões e parâmetros exemplares de varredura de linha. Observe que o gel DGT é horizontalmente virado quando transferido do solo da rizosfera para a placa de vidro, conforme indicado pela posição do retângulo no canto inferior do gel DGT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Processamento e calibração de dados Importar o arquivo de dados brutos (.xl) para cada linha ablada em software de planilha(Tabela de Materiais). A tabela de dados brutos mostra as leituras ICP-MS (pontos de dados) para cada isótopo em cps e os pontos de tempo correspondentes em s. Liste todas as linhas umas das outras em colunas diferentes. Avalie os dados de varredura de linha para estabilidade de sinal do padrão interno (13C) e tempos adequados de lavagem. Calcule um gás em branco médio para cada isótopo de todos os valores em branco de gás registrados antes das ablações da linha (ou seja, durante o tempo de aquecimento do laser) e subtraia o gás médio em branco das intensidades brutas correspondentes para cada isótopo para corrigir para o sinal de fundo. Aplique a normalização interna dividindo a intensidade do sinal de cada isótopo (cps) pela intensidade do sinal do padrão interno (cps) para cada ponto de dados para corrigir as variações na quantidade de material ablado e deriva instrumental. Lavo os dados antes do início e após o fim de cada linha ablada para remover o sinal de fundo. Transponha a tabela de dados para obter uma matriz de grade onde cada linha corresponde a uma linha ablada e cada coluna a um valor de intensidade de isótopos normalizado. Separe as matrizes de cada isótopo em planilhas individuais. Calcule a razão média de intensidade de sinal normalizada por isótopo para os padrões de calibração e calibração em branco e calcule a função de calibração (y = ax + b) utilizando um modelo de regressão linear com os carregamentos de analito padrão gel (μg cm-2; ver SI S4) como x-valores. Avalie a função de calibração de cada isótopo para linearidade47. Aplique a função de calibração na matriz de dados da amostra. Converta as razões de intensidade de sinal normalizada, para carregamentos de analitos de gel, (μg cm-2), e posteriormente para fluxos solúcidas medianos de tempo, (pg cm-2 s-1), para cada isótopo e ponto de dados de acordo com Eq. 4 e Eq. 5:Aqui, a é a inclinação da linha de calibração, b é a interceptação da linha de calibração, e t (s) é o tempo de implantação do gel durante a amostragem soluto. Salve a matriz de dados de amostra calibrada para cada analito como arquivo txt. Geração de imagensNOTA: Certifique-se de evitar qualquer operação de interpolação de pixels durante todas as etapas da geração de imagens, pois isso pode levar a gradientes de fluxo soluto artificialmente suavizada nas imagens resultantes. Importar a matriz de dados de amostra calibrada (.txt) como imagem de texto no software de análise de imagem(Tabela de Materiais). Calcule a distância por pixel na direção x (ou seja, resolução lateral) multiplicando a velocidade de varredura a laser com a duração total do ciclo de varredura ICP-MS (por exemplo, assumindo uma velocidade de varredura de 200 μm s-1 e uma duração total do ciclo de varredura de 0,25 s, a resolução lateral equivale a 50 μm). A distância por pixel na direção y equivale à distância interline(Figura 6). Calcule o fator de correção da proporção da imagem. Portanto, divida a distância por pixel na direção y (por exemplo, 300 μm) pela distância por pixel na x-direção (por exemplo, 50 μm). Aplique o fator de correção y/x obtido (neste exemplo 6) em ‘Escala’. Aplique a distância por pixel (em μm ou mm) na direção x como escala em ‘Escala de conjunto’. Aplique uma escala de ‘Look Up Table’ou seja, pseudocoloração para melhor visualização de gradientes químicos na imagem solute e ajuste a imagem ‘balance de cor’ para controlar os limites inferiores/superiores da faixa de exibição. Adicione uma’barra de calibração’ e salve a imagem solute como arquivo de tiff. Copie a imagem solute usando o comando ‘Copiar para Sistema’ no software de análise de imagem e colar em software de publicação de desktop(Tabela de Materiais). Dimension-match, alinhar e compor a imagem soluto com a foto do ROI obtida em 3.1.7.NOTA: Antes de copiar, redimensione a imagem soluto por exemplo, fator 10 através da aplicação de uma ‘Escala X’ de 10 e uma ‘Escala Y’ de 10 em ‘Escala de conjunto’ para garantir pixels suficientes para publicação de alta resolução. Fabricação de gel DGT Cultivo de plantas Amostragem de solute in situ Mapeamento de fluxo de solute LA-ICP-MS HR-MBG1 semana Preparação do solo1 semana Aplicação de gel1 hora por gel Preparação da amostra1 hora por gel HR-ABG3 dias Montagem de rizotron2 horas por réplica Período amostral de solutovariável, tipicamente 24 horas Análise LA-ICP-MS1 dia por gel HR-CBG3 dias Crescimento da plantadependente do estudo Recuperação de gel1 hora por gel processamento de dados4 horas por gel Secagem de gel2-3 dias Geração de imagens10 min por imagem Tabela 1: Tempos aproximados para etapas gerais da técnica DGT LA-ICP-MS.