JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

In Situ X-ışını Kırınım Çalışmaları için Mikrodiyaliz ile Çip Üzerindeki Proteinlerin Kristalizasyonu

Published: April 11, 2021
doi:
10.3791/61660
, , , , ,
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258,Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

Summary

Bu makalede, diyaliz yöntemi ve yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için geliştirilen mikroakışkan çiplerin imalat protokolü ayrıntılı olarak açıklenmektedir. Mikrofabrikasyon işlemi, yarı geçirilebilir yenilenmiş selüloz diyaliz membranın, çipin iki katmanı arasında herhangi bir moleküler ağırlık kesme ile entegre olmasını mümkün kılar.

Abstract

Bu protokol, diyaliz yöntemiyle çip üzerindeki proteinleri kristalleştirmek ve oda sıcaklığında yerinde tek kristal veya seri kristalografi deneylerine izin vermek için tüm boru hattını kapsayan tekrarlanabilir ve ucuz mikroakışkan cihazların üretimini açıklar. Protokol, mikroçiplerin imalat sürecini, çip üzerindeki kristalizasyon deneylerinin manipülasyonunu ve protein örneğinin yapısal elucidasyonu için toplanan X-ışını kırınım verilerinin tedavisini detaylandırıyor. Bu mikrofabrikasyon prosedürünün temel özelliği, çipin iki katmanı arasında ticari olarak mevcut, yarı geçirilebilir rejenere selüloz diyaliz membranın entegrasyonunda yatır. Gömülü zarın moleküler ağırlığı makromolekül ve çökeltilerin moleküler ağırlığına bağlı olarak değişir. Cihaz, dakika hacimlerinde numune (<1 μL) kullanımı ve taşıma olaylarına göre ince ayar gibi mikroakışkan teknolojinin avantajlarından yararlanır. Çip onları diyaliz yöntemiyle birleşerek kristalizasyon süreci üzerinde hassas ve geri dönüşümlü kontrol sağladı ve mikroliter ölçeğinde proteinlerin faz diyagramlarını araştırmak için kullanılabilir. Cihaz, optik olarak şeffaf bir polimerik substrat üzerinde yumuşak baskı litografisi ile fotokür edilebilir tiyol bazlı bir reçine kullanılarak desenlenmiştir. Ayrıca, mikroçipleri oluşturan malzemelerin arka plan saçılması ve arka plan gürültüsünün üretilmesi, çipin yerinde X-ışını kırınım deneyleri için uyumlu hale getirilmesi değerlendirildi. Protein kristalleri yeterli boyuta ve popülasyon homojenliğine kadar çip üzerinde yetiştirildikten sonra, mikroçipler doğrudan 3D baskılı bir tutucu yardımıyla X-ışını ışınının önüne monte edilebilir. Bu yaklaşım, geleneksel protein kristalografisi deneylerinde kriyoprotektiflerin kullanımından ve manuel hasattan kaynaklanan zorlukları kolay ve ucuz bir şekilde ele alıyor. Yapı tespiti için oda sıcaklığında çip üzerinde yetiştirilen çoklu, izomorf lysozyme kristallerinden komple X-ışını kırınım veri setleri toplanarak elde edildi.

Introduction

Biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu (3D) yapısının aydınlatıcı olması, X-ışını kristalografisinin temel araştırma tekniği olarak kaldığı yapısal biyolojide durdurulamaz bir takiptir. Proteinler gibi karmaşık makromoleküllerin yapısal ayrıntılarını çözmek için uygulanan, eylem mekanizmalarının anlaşılmasını ve çeşitli biyolojik işlevlere dahil olmalarını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Senkrotronlardaki güçlü X-ışını kaynakları ve X-ışını serbest elektron lazerleri (XFEL’ler), proteinlerin yapısı hakkında atomik çözünürlüğe yakın daha derin bir içgörü için gereken tüm araçları sağlar. Yapısal çalışmalar için X ışınlarının kullanımı ile birlikte gelen avantajlara rağmen, X-ışını radyasyonu ve kristalleşme sürecinin kendisi için içsel sınırlamalar vardır. Yüksek X-ışını akısının neden olduğu radyasyon hasarı ve X-ışını ışınının önündeki protein kristalinin uzun maruz kalma süreleri, kristalografların kriyojenik soğutma kullanarak aşmaları gereken kısıtlayıcı parametrelerdir1. Bununla birlikte, en uygun kriyokooling koşullarını bulmak zahmetli olabilir, çünkü yerel protein yapısından veya eserlerden gelen konformasyon değişikliklerigizlenebilir 2,3. Ayrıca, son çalışmalar oda sıcaklığında kırınım deneyleri yapmanın daha düşük spesifik radyasyon hasarına yol açtığını göstermektedir4. Yapısal biyolojideki bir başka darboğaz, yeterli boyutta5ile iyi dağınık kristallerin eldeılmasıdır. Küçük kristallerin üretilmesi daha kolaydır, özellikle membran proteinleri durumunda, ancak kriyosooling koşullarında bile radyasyon hasarına daha duyarlıdır, çünkü yüksek radyasyon dozu daha büyük protein kristalleri durumuna kıyasla daha küçük bir hacimde yönlendirilmelidir6. Seri kristalografi7,8’in senkrotronlarda ve XFEL’lerde yeni yaklaşımı, radyasyon hasarının kısıtlamalarını atlatabilir ve aynı zamanda veri kümelerini birden fazladan birleştirerek daha küçük kristallerden (200 nm ila 2 μm)7 yararlanabilir, izomorf ve rastgele yönlendirilmiş protein kristalleri ve femtosaniye darbeler, daha kısa maruz kalma süreleri ve mikro odaklı X-ışını ışınları5,7, 9,10gibi ilişkili teknolojik gelişmelerden kazanç.

Mikroakışkan teknoloji, biyolojik makromoleküllerin kristalleşmesi ve yapısal incelemeleri için manifold avantajları sergileyen X-ışını kristalografisi için değerlidir. Mikroakışkan cihazlarda kristalizasyon deneyleri yapmak, küçük miktarlarda protein örneği gerektirir, bu nedenle bu yüksek değerli biyo makromoleküllerin üretim maliyetini kısıtlar ve çok sayıda kristalizasyon koşulunun yüksek verimli taramasını ve optimizasyonunu kolaylaştırır. Ayrıca, mikroakışkan ölçekte ve difüzyon sınırlı taşıma olaylarındaki doğal geniş yüzey alanı-hacim oranı, akışlar ve sıcaklık veya konsantrasyon gradyanları11, 12,13,14üzerinde ince kontrolsağlar,eşit büyüklükte kristaller yetiştirmek ve faz diyagramlarını keşfetmek için uygun mikroakışkan cihazlarınişlenmesini sağlar 15,16,17,18,19. Ayrıca, mikroakışkan araçlar, numune teslimi olan protein kristalografisinde başka bir engeli ele almak için ayırt edici bir potansiyel ve X-ışını kırınım deneyleri için kullanılmadan önce protein kristallerini kullanma ve hasat etme gerekliliğini gösterir. Çip üzerinde ve yerinde X-ışını kristalografisi yöntemi, veri toplamadan önce kristal manipülasyonu ve kristal kalitesinin potansiyel bozulmasını ortadan kaldırır. Yerinde X-ışını protein kristalografisi için uyumlu çok çeşitli mikroakışkan çipler, mikrofabrikasyon malzemelerinin doğasından kaynaklanan ilgili kısıtlamalarla ve X-ışınları14 , 19, 20 ,21 , 22,23ile etkileşimlerinden kaynaklanan birçok araştırma grubu tarafından tasarlanmış, geliştirilmiş ve test edilmiştir. İmalat malzemeleri optik olarak şeffaf, biyolojik olarak hareketsiz olmalı ve X-ışını radyasyonunda yüksek şeffaflık ve veri toplama sırasında optimum sinyal-gürültü oranı göstermelidir.

Geleneksel protein kristalografisinde uygulanan kristalizasyon yöntemlerinin çoğu24,25 de çip kristalizasyonu ve yerinde X-ışını kırınım analizi için mikroakışkan ölçek11,14’te uygulanmıştır. Buhar difüzyonu26,buharlaşma 27, serbest arayüz difüzyonu (FID)28,mikrobatch26ve hatta tohumlama29içeren basit, hibrit veya çok katmanlı mikroakışkan aparatlar çözünür ve membran proteinlerini kristalleştirmek için kullanılmıştır. Kristalizasyon koşullarının yüksek verim taraması ve optimizasyonu, iyi tabanlı32, damlacık bazlı33 veya valfle hareket ettirilen34cihazda30,31 elde edilebilir. Yerinde Pdms (polidimetilsiloxane), COC (siklik olefin kokolimer), PMMA (poli(metil methakrilat))21gibi çeşitli malzemelerden üretilen mikroçiplerde oda sıcaklığında zorlu protein hedeflerinin X-ışını kırınım deneyleriyapılmıştır.22,26,28,29, grafen filmler23, Kapton35, epoksi tutkal6veya NOA (Norland Optik Yapıştırıcı)19 ve malzemelerin X-ışını radyasyona şeffaflığı ve arka plan gürültüsüne katkıları değerlendirilmiştir. Ayrıca, mikroçipler in situ ve seri veri toplama stratejilerini senkrotron kaynakları23, 35,36 ve XFELs7’deX-ışınıproteini kristalografi deneyleri için tek bir araçta bire bir çift olarak tasarlanmıştır.

Oda sıcaklığı yerinde veri toplama çeşitli teslimat yöntemleri ve cihazlarında da uygulanmıştır. Örneğin, Nogly ve ark.54, bir XFEL kaynağı kullanarak seri femtosaniye kristalografi (SFX) ile ışık tahrikli foton pompa bakterihodopsinin (bR) yapısını incelemek için bir lipidik kübik faz (LCP) enjektörü kullandı. bR’nin kristal yapısı 2.3 şçözünürlüğe kadar çözüldü ve bir LCP enjektörünün zaman çözülen seri femtosaniye kristalografi (TR-SFX) ile uyumluluğunu gösterdi. Baxter ve ark.55, çeşitli boyutlarda lazer kesim delikli 100 veya 200 μm kalınlığında polikarbonat plastik ile üretilen yüksek yoğunluklu çok kristalli bir ızgara tasarladı. Cihazı oturma veya asılı bırakma kristalizasyon deneyleri için kullanırken ızgaranın bir tarafına 5 μm kalınlığında ek bir polikarbonat film sabitlenebilir. Kristaller doğrudan cihazın bağlantı noktalarına yüklenebildiğinden veya kristaller vapor difüzyonu veya LCP yöntemiyle cihazda yetiştirilebildiğinden, bu yüksek yoğunluklu ızgara birden fazla şekilde kullanılabilir. Ayrıca, ızgara standart bir manyetik tabanda ayarlanabilir ve kriyojenik veya oda sıcaklığı koşullarında yerinde X-ışını veri toplama için kullanılabilir. Daha yakın zamanda, Feiler ve ark.56, minimum arka plan gürültüsü katkısıyla kriyojenik ve ortam sıcaklığında makromoleküler in situ X-ışını kristalografisi için bir örnek tutucu geliştirdi. Özellikle, tutucu plastik bir destek, şeffaf bir COC folyo ve mikro gözenekli yapılandırılmış poliimid folyodan oluşur. Kristalleşme damlalarını ayarlamak için yaygın olarak kullanılan kapak slaytlarını değiştirmek için tasarlanmıştır, aynı şekilde kristalleşme damlasını açmadan veya kristalleri manuel olarak kullanmadan ligand ıslatma, karmaşık oluşum ve kriyojenik koruma gibi yerinde manipülasyona izin verir. Ayrıca, numune tutucu kristalizasyon plakasından çıkarılabilir ve standart goniometre tabanlı kiriş hatlarında yerinde veri toplanması için manyetik bir tabana yerlenebilir. Ortam sıcaklığı veri toplama için, COC folyo deneyden önce çıkarılır ve sadece 21 μm kalınlığındaki poliimid folyo, bu durumda minimum olan arka plan saçılımlarına katkıda bulunur. Bu örnekler, devam eden araştırmaların ve X-ışını protein kristalografisi için geliştirilen çok yönlü mikroçiplerin çokluğunun sadece küçük bir kısmını oluşturmaktadır.

Bununla birlikte, diyaliz proteini kristalizasyon yöntemi mikroakışkanlar içinde yaygın olarak dahil edilmiştir. Diyaliz, protein kristalizasyonu için nominal konsantrasyona yaklaşmak için çökelti konsantrasyonunun yarı geçirgen bir membran yoluyla dengelenmesine yönelik difüzyon bazlı bir yöntemdir ve kristalizasyon koşulları üzerinde hassas ve geri dönüşümlü kontrol sağlar24. Yarı geçirgen diyaliz zarının Moleküler Ağırlık Kesmesi (MWCO), makromolekülün moleküler ağırlığına ve çökelticilerin, ilgi makromoleküllerini korurken küçük çökelti moleküllerinin difüzyonunu sağlamak için seçilebilir. Diyaliz işleminin tersine çevrilebilirliği nedeniyle, aynı protein örneğini kullanırken çökelti konsantrasyonunu değiştirerek faz diyagramlarını araştırmak için çekirdeklenmeyi ve kristal büyümesini bağımsız olarak37’ye ayırıp optimize etmek için sıcaklık kontrolü ile birlikte kullanılabilir. Membranların mikroakışkanlara entegrasyonu de Jong ve ark.38 tarafından gözden geçirilir ve biyoloji implante diyalizinde örneklem hazırlama, konsantrasyon veya filtrasyon uygulamalarında esas olarak39, 40,41,42 veya hücre ile ilgili çalışmalar43,44olarak sıralanabilir. PDMS yoluyla pervaporasyon, Shim ve ark.37 tarafından çeşitli koşullarda ksilanazın çekirdeklenmesini ve büyümesini incelemek için kullanılmıştır. Su, 15 μm kalınlığındaki PDMS membrandan mikroakışkan cihazın protein rezervuarına nüfuz etti ve daha sonra protein ve çökelti konsantrasyonunu değiştirdi.

Junius ve ark.19,45 tarafından hem mikrodiyaliz yoluyla çip üzerinde protein kristalizasyonu hem de oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım deneyleri için uyumlu bir mikroakışkan çipin imalatı için geliştirilen protokol sunulmaktadır. Cihaz imalatı protokolü, studer ve iş arkadaşları12,46 tarafından, yumuşak baskı litografisi kullanılarak ticari olarak mevcut membranları gömen foto kürlenebilir tiyol bazlı reçine NOA 81’in mikro desenli çıkartmaları için gerçekleştirilen öncü çalışmalardan doğrudan esinlenilmiştir. Yöntemin yenilikçi bir modifikasyonu, protein kristallerinin çip üzerinde büyümesi için deneysel parametreleri doğru bir şekilde izlemek ve kontrol etmek ve aynı zamanda deney başına protein örneklerinin tüketiminin azalması (20 μL) uygulanan diyaliz ilkeleri gösterilmiştir47. Bu çalışmada, çip üzerinde kristalizasyon tahlilleri ve yerinde X-ışını kırınımı veri toplamayı gerçekleştirmek için farklı MWCO’nun rejenere selüloz (RC) diyaliz membranlarını içeren diyaliz mikroçipleri üretmek için bir protokol açıklanmıştır. Mikroçipleri oluşturan malzemeler X-ışınları19’a saydamlıkları açısından değerlendirilmiştir ve cihazlar, manuel kullanım ve kırılgan protein kristallerinin bozulmasını en aza indirme hariç, yerinde oda sıcaklığı kırınım deneyleri için doğrudan X-ışını ışınının önüne ayarlanabilir. Bir vaka çalışmasında, tavuk yumurtası-beyaz lysozyme kristalleri, eşit büyüklükte bir popülasyon oluşturan mikrodiyaliz yoluyla çip üzerinde yetiştirildi. Mikroçip daha sonra 3D baskılı destek19 ile X-ışını ışınının önüne monte edildi ve oda sıcaklığında birden fazla izomorf kristalden tam yerinde kırınım veri setleri toplanarak, zorlu makromoleküler hedeflerin senkrotron seri kristalografi çalışmaları için çiplerin yüksek potansiyelini ve alaka düzeyini gösterdi.

Protocol

1. Maske tasarımı ve ana imalat Herhangi bir vektörel çizim yazılımı kullanarak mikroakışkan cihazın istenen geometrilerini çizin. Fotolithografinin bir sonraki adımı için kullanılacak fotoresistin her katmanı için ayrı bir maske hazırlayın: kanallar ve sütunlarla özetlenmiş bir maske ve sadece sütunları içeren bir maske. Çizim yazılımı tarafından oluşturulan CIF dosyalarını film foto maskelerine çevirin. Bu ticari hizmetler aracılığıyla yapılabilir. Fotolithografi sırasında kullanılan fotoresist seçimine bağlı olarak uygun foto maskeyi gerektirir.NOT: SU-8 fotoresist için şeffaf bir arka plan üzerinde siyah özelliklere sahip maskeler sipariş edin. SU-8, epoksi bazlı negatif bir fotoresisttir, bu da UV ışığına (365 nm) maruz kalma sırasında UV’ye maruz kalan parçaların çapraz bağlı olduğu, geri kalanının ise çözünür kaldığı anlamına gelir. Bu nedenle, maske üzerindeki tüm siyah desenler fotolithografi sırasında UV ışığı ile çapraz bağlanmayacaktır. Ustaların üzerine kanallar ve sütunlar kazınacak. SU-8 negatif fotoresist kullanarak fotolithografi ile her çipin tasarımı için silikon gofretler üzerinde iki usta hazırlayın.NOT: Adım 1.3.1-1.3.7 temiz bir odada gerçekleştirilir. Aşağıda açıklanan adımlar, birçok ders kitabında açıklanan PDMS yumuşak litografisinin ardından geleneksel fotolithografi adımlarıdır. Deneysel parametrelerin tüm değerleri (fotoresist, zaman süresi, sıcaklık vb.) birçok ince parametreye bağlıdır ve kullanılan farklı aparatlara bağlı olarak optimize edilmelidir. SU-8 fotoresistinin birikmesini ve bağlanmasını kolaylaştırmak için 3 inç silikon gofret kullanın ve yüzeyi 90 s plazma ile tedavi edin. Gofretin ortasına kabaca 3 mL SU-8 direnci dökün ve SU-8’i istediğiniz kalınlıktadöndürün ( Şekil 1A). 50 μm nominal kalınlık için SU-8 3050 ve spin coat’u 500 rpm’de 10 s ve 3500 rpm’de 30 s için art arda kullanın. Reçinede bulunan çözücünün buharlaşmasını ve fotoküme yapışmasını önleyerek kısmen katılaşmak için fotoresisti 368 K’da 15 dakika sıcak bir tabakta yumuşak bir şekilde pişirin. Daha sonra, gofreti oda sıcaklığında 2 dakika bekletin. Fotoresisti UV ışığına maruz bırak (Şekil 1B). 35 mW cm-2 ve 8 s pozlama süresine sahip bir maske hizalayıcı kullanın. Maruz kalma sonrası pişirmeye devam edin. UV maruziyeti tarafından çağrılan fotoreaksiyonun tamamlanması için gofreti 368 K’da 5 dakika sıcak bir tabağa yerleştirin. Gofreti propilen glikol metil eter asetat (PGMEA) içeren bir banyoya yerleştirerek çapraz bağlantısı olmayan tüm SU-8 direncini çıkarın ve 15 dakika karıştırın. Bulanık yağış gözlenene kadar gofreti izopropanol ile durulayın. Gofret azot gazı ile kurutun ve bir Petri kabında (100 mm x 15 mm standart boyut) saklayın. 2 pul imal etmek için kullanılacak polidimetilsiloksan (PDMS) müfrezesini kolaylaştırmak için gofretin yüzeyini bir silane ile tedavi edin. Gofreti, hexamethyldisilazane (HMDS) buhar atmosferi altında 10 dakika boyunca 368 K’da dokunmuş bir sıcak tabağa yatırın.NOT: Pdms’yi gofretten soymak birkaç kullanımdan sonra zorlaşırsa, gofret yüzeyi hmds buharı ile tekrar tedavi edilmelidir. Kanalları ve sütunları içeren ilk usta hazır. Bu adımları yineleyin ve yalnızca sütunları desenleyen ikinci ana deseni hazırlayın.NOT: Fotolithografi sırasında amaç, cihazın geometrilerini 50 μm yüksekliğe sahip SU-8 master’larında elde etmektir. Bununla birlikte, iki SU-8 ustası imal edildikten sonra, deneysel değeri elde etmek için ustalara kazınmış geometrilerin yüksekliğini bir profilometre ile ölçün. Bu protokol için üretilen her iki SU-8 ustası için ölçülen değer yaklaşık 45 μm’dir. 2. PDMS kalıp imalatı NOT: Protokolün aşağıdaki adımları laminer akış başlığı kullanıldığı sürece herhangi bir laboratuvarda yapılabilir, NOA 81 reçinesi (adım 3.6-3.11) ile çalışırken odadaki sarı ışık kullanılır ve NOA 81 reçinesinin polimerizasyonu için bir UV ışığı kaynağı mevcuttur (adım 3.7 ve 3.11). 50 g PDMS silikon tabanını ve kür maddesini 10:1 kütle oranında hazırlayın. Her iki malzemeyi de bir spatula ile bir beherde karıştırın ve tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için karışımı bir vakum odasına yerleştirin. Kanalları ve sütunları yaklaşık 5 mm yüksekliğe kadar desenleyen SU-8 master’a (Petri kabında saklanır) 25 g önceden karıştırılmıştır PDMS dökün. PDMS’nin kalan 25 g’ını, yalnızca yaklaşık 5 mm yüksekliğe kadar olan sütunları desenleyen ikinci SU-8 ana desenine dökün(Şekil 1C). Petri tabaklarının her ikisini de bir fırına yerleştirin ve PDMS katmanlarını 338 K’da 1 saat boyunca iyileştirin. Su-8 ustalarının desenlerinin etrafındaki kürlenmiş PDMS tabakasını bir neşterle kesin ve PDMS kalıplarını ustalardan hafifçe soyun (Şekil 1D).NOT: Yukarıda açıklanan ve replika kalıplama olarak adlandırılan prosedür, cam yüzeylere takılacak ve mikroakışkan bir cihazın parçası olacak PDMS kalıplarını hazırlamak için sıklıkla kullanılmaktadır53. Bu protokolde, PDMS kalıpları çipin bir parçası değildir, ancak talaş imalatı için ara olarak kullanılırlar. Her tasarım için, ilgili SU-8 ustalarından (Şekil 1D ve 1E) 2PDMS kalıpları hazırlanır ve mikroçip üretimi için buna göre (aşağıda açıklandığı gibi) kullanılacaktır. 3. Diyaliz çipi imalatı PDMS kalıp desenlerini hem kanalları hem de sütunları sert bir mikroskop cam kaydırağa (3 x 1 in. standart boyut) yerleştirin ve desenler yukarı bakacak şekilde(Şekil 1F). Protein rezervuarı ile karşılık gelen merkezi sütun, PDMS kalıbının yatay yüzeyinden dikey olarak 45 μm aşıyor. Rejenere selüloz (RC) diyaliz zarının kuru bir parçasını kesin ve ayırın ve cam slaytta desteklenen PDMS kalıbının orta direğine biriktirin (Şekil 1F).NOT: RC diyaliz membranı ticari olarak mevcuttur ve moleküler ağırlık kesme (MWCO) incelenmekte olan proteinin moleküler ağırlığı ve kullanılan çökeltiler ile buna göre seçilir. RC diyaliz zarının parçasının boyutu çipin tasarımına bağlıdır. Bu protokolde, protein rezervuarının hacminin 0,1 veya 0,3 μL olduğu 2 prototip tasarlanmıştır. Bu durumlarda, diyaliz membran parçasının boyutu sırasıyla 2 x 2 mm2 veya 4 x 4 mm2’dir. İkinci PDMS kalıp desenini sadece aşağı bakan sütunları cam slaytta desteklenen PDMS kalıbının üstüne yerleştirin(Şekil 1F). Bu kalıbın merkezi ayağı protein rezervuarı ile karşılık gelir ve yatay yüzeyden dikey olarak (aşağı bakacak şekilde) 45 μm’yi aşar. 2 PDMS kalıbının orta sütunlarını hizalayın. RC diyaliz membranı 2 PDMS kalıbı arasında “sandviç” edilir (Şekil 1G).NOT: 2 PDMS kalıbının mikroyapıları arasındaki hizalama, herhangi bir ekstra ekipman olmadan görsel olarak gerçekleştirilebilir. Aksi takdirde, bu manipülasyon mikroskop altında elde edilebilir. Akışkan kanal ve giriş veya çıkış noktaları tamamen kapsanmadığı sürece rezervuarlar arasında küçük bir kayma sorunlu değildir. PDMS kalıplarındaki tüm sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarmak ve imalatın bir sonraki adımı sırasında reçinenin yerleştirilmesini teşvik etmek için montajı bir vakum odasında 30 dakika boyunca kurulayın.NOT: 2 PDMS kalıbı PDMS-PDMS yapışıklığında yerinde tutulur ve ekstra basınç veya başka bir geçici yapıştırma yolu gerekmez. 2 PDMS kalıbı arasındaki boş boşluğu fotokürlenebilir, tiyol bazlı reçine NOA 81 ile kılcal imbibition(Şekil 1H ve 1I)ile doldurun. Reçineyi, kolimlenmiş bir UV lambası (güç 35 mW cm-2)kullanarak 8 s için UV ışığına (365 nm) maruz kalarak iyileştirin.NOT: Bu ilk pozlama, noa 81 reçinesinin kısmen birbirine bağlı olmasını sağlar, çünkü her iki taraftaki PDMS kalıplarıyla temas eden ince bir NOA 81 tabakası kesilmemiş kalır. NOA 81’in fazlalığını neşterle PDMS kalıplarının dış taraflarından kesin. Üst PDMS kalıbını, kısmen çapraz birbirine bağlı NOA 81 ile alt PDMS kalıbından ve cam kaydıraktan çıkarın. Mikroskop cam kaydırağın (3 x 1 inç) standart boyutlarında 175 μm kalınlığında bir PMMA levhası kesin ve PMMA parçasının her iki tarafındaki plastik koruma levhalarını soyun. Üst PDMS kalıbının montajına ve kısmen kürlenmiş NOA 81’e PMMA parçasına hafifçe bastırın (Şekil 1J). 60 s için UV ışığına maruz kalarak noa 81’i tekrar tedavi et ve üst PDMS kalıbını çıkar (Şekil 1K). Reçine, başka bir işlem yapmadan PMMA substrata yapışır.NOT: PDMS kalıpları, kalıplar bükülmediği sürece izopropanol ve aseton ile yıkandıktan sonra yaklaşık 5 kata kadar yeniden kullanılabilir. RC diyaliz membranı NOA 81 etiketine dahil edilir ve daha fazla manipülasyon veya mekanik sıkıştırma gerekmez. 4. Akışkan konnektörler NOT: Mikroakışkan çipin tasarımı, kristalizasyon çözeltisi için doğrusal akışkan bir kanaldan ve protein örneği (protein rezervuarı) için merkezi bir rezervuardan oluşur, her ikisi de Şekil 2A’daiki mikroçip üst görünümünden gösterilmiştir. Bu iki mikroyapı (Şekil 2D)arasına bir RC diyaliz zarı gömülüdür ve kristalizasyon çözeltisinden çökeltiler, çipin membranla ayrılan iki bölmesi arasındaki konsantrasyon gradyanı nedeniyle membran boyunca yayılırken kristalleşme süreci gelişir. Mikroakışkan kanal alt PDMS kalıbına basılmıştır (Şekil 1F). Yongalar için imalat protokolü tamamlandıktan sonra, doğrusal kanal, Şekil 1K’da gösterildiği gibi PMMA substratı ile temas halinde NOA 81etiketinin alt katmanında bulunur. Kristalizasyon çözeltisi için bir giriş ve çıkış erişim noktası doğrusal kanalın her iki ucunda bulunur ve Şekil 2A’dagörülebileceği gibi deliklere (toplam yükseklik 90 μm) benzemektedir. Kristalizasyon çözümünün işlenmesi için, erişim noktalarına konektörler eklenmelidir. Hızlı epoksi tutkallı mikroakışkan kanalın girişinde ve çıkışında ticari olarak bulunan bond konektörleri (NanoPort) (Şekil 2C). Konnektörlerin boyutuna göre PTFE tüplerinin uygun çapını seçin. PTFE tüpleri, çipin akışkan kanalında kristalizasyon çözeltisinin tanıtımı için kullanılacaktır.NOT: Ticari olarak mevcut kitler, akış hızı üzerinde kolay ve hassas kontrol için tavsiye edilir ve genellikle karıştırma ve sıvı taşıma için otomatik basınç tahrikli veya akış kontrollü (şırınna pompaları) sistemlerle birleştirilir. Bununla birlikte, kristalizasyon çözeltisi tek kullanımlık plastik şırınna ile doğrusal kanala manuel olarak sokulabilir. Bu durumda, 4.3 ile 4.5 arasında adımlar önerilir. Kristalizasyon çözeltisi ile 1 mL tek kullanımlık şırınna doldurun. Bu protokolde sunulan çipler için, tüm akışkan kanalı doldurmak için 400 μL yeterlidir. Bir taraftaki ucun çapı, çözelti işleme için kullanılacak PTFE tüpünün iç çapına eşit olacak şekilde iki pipet ucu kesin. Kırpılmış uçları kanalın erişim noktalarına hızlı epoksi tutkalla yapıştırın (Şekil 2B). Şırınnayı kırpılmış uçlarla uygun boyutta bir PTFE tüpü parçasıyla bağlayın ve şırınna pistonu sürekli yavaş iterek çözeltiyi kanal içinde tanıtın. 5. Protein kapsülleme NOT: Protein rezervuarı olarak kullanılmaya adanmış çipin deseni atmosfere açık kalır. Aşağıdaki protokol, protein örneğini mikroakışkan çip içinde dikkatlice sınırlamak için önerilmiştir. Şekil 2E’degösterildiği gibi, RC diyaliz zarının hemen üzerinde bulunan protein rezervuarının içindeki protein örneğinin bir damlacığı manuel olarak pipet. Protein örneğinin hacmi çipin tasarımına göre değişir ve 0.1 veya 0.3 μL olabilir. Protein rezervuarının etrafına ince bir yüksek vakumlu silikon gres tabakası uygulayın. 175 μm kalınlığında pmma levhanın küçük bir parçasını kesin ve silikon yağın ince tabakasının üzerine hafifçe yerleştirin. PMMA parçası, protein çözeltisinin biriktirildiği protein rezervuarının tüm yüzeyini kaplamalıdır.NOT: Silikon gres, hava sızdırmazlığını arttırmak ve protein damlacığının yayılmasını önlemek için kullanılır. Protein rezervuarını kaplamak için kullanılan PMMA parçası ile NOA 81 etiketi arasında yapıştırma veya sızdırmazlık yoktur. Aralarındaki temas sağlam/sağlam bir arayüzdür. Protein örneğinin genel bir sızdırmazlık ve hava geçirmez kapsüllenmesi için, adım 5.4’te açıklandığı gibi bir Kapton bandı parçası kullanılır.NOT: Akışkan kanal içinde kristalizasyon çözeltisinin piyasaya sürülmesi için basınç tahrikli bir sistem kullanıldığında protein örneğini cihazın özel boşluğuna (protein rezervuarı) hapsetmek bazen zordur (adım 6.4). Yukarıda belirtilen sorunu önlemek için kristalizasyon çözeltisi dolaşımdayken nispeten düşük basınç değerleri korunmalıdır. Sulu çözeltiler için 20-60 mbar veya daha viskoz çözeltiler (PEGs, gliserol) için 50-150 mbar enjeksiyon basıncı önerilir19. Protein rezervuarının üzerinde kurulu PMMA parçasını kaplayacak ve tüm kenarlarda NOA çipine yapışacak kadar büyük bir Kapton bant (20 μm kalınlığında) kesin. Protein örneği rezervuar içinde kapsüllenmiştir ve çip Şekil 2C’degösterildiği gibi kristalizasyon deneyi için kullanılmaya hazırdır.NOT: Diyaliz zarı ve NOA’nın PMMA substratındaki yapıştırılması bozulmadığı sürece talaşlar birkaç kez tekrar kullanılabilir. Çipin bu parçaları hasar görürse, cihazın artık kullanılamayacağını doğrulayan sızıntılar gözlenir. Talaşların yıkanması kristalizasyon çözümüne bağlıdır. Düşük viskoziteli çözeltiler (tuzlar, tamponlar) durumunda, akışkan kanal sadece damıtılmış su sokularak yıkanabilir ve birkaç dakika akmasına izin verebilir. 400 μL, kanal içindeki bir çözeltiyi başka bir çözelti ile tamamen değiştirmek için gereken hacimdir. Daha viskoz çözeltiler (PEG’ler, gliserol) durumunda, kanalı sadece suyla yıkamak yeterli olmadığından talaşların yeniden kullanılması önerilmez. Protein rezervuarının bulunduğu çipin üst kısmı damıtılmış su ile yıkanabilir ve basınçlı hava ile kurutulabilir. 6. Çip üzerinde protein kristalizasyonu Lyophilized tavuk yumurta-beyaz lysozyme toz tartın ve 30 mg mL-1nihai konsantrasyon elde etmek için damıtılmış suda çözün. Tüm katı parçacıkları çıkarmak için protein çözeltisini 0,22 μm filtre ve santrifüjden 293 K’da en yüksek hızda 5 dakika filtreleyin. Kristalizasyon deneyi için süpernatant kullanın. Tablo 1’de sağlanan konsantrasyonlarda tamponu ve çökeltiyi içeren 500 μL kristalizasyon çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 μm filtre ile filtreleyin. Çözeltiyi, 4.1-4.5 adımlarında açıklandığı gibi bir şırınna veya otomatik basınç tahrikli akışkan sistem veya şırınna pompası ile çipin giriş noktasına enjekte edin.NOT: Kristalizasyon deneyi, mikroakışkan kanal kristalizasyon çözeltisi ile doldurulup bir kenara bırakılırsa veya sürekli olarak kanalın içine sabit bir akış hızında enjekte edilirse, statik durum altında gerçekleşebilir. İkinci durumda, harici bir basınç tahrikli sistem veya şırınna pompası kullanılması önerilir. Deneyin akışkan koşullar altında gerçekleştirilmesi, akışkan kanal içinde kristalizasyon çözümlerini dinamik olarak değiştirme imkanı da sağlar. Böylece, aynı protein örneği kullanılarak birden fazla deney yapılabilir. Akışkan kanal kristalizasyon çözeltisi ile doldurulduktan sonra, çipin giriş ve çıkış bağlantı noktalarını parafilm bandı ile kapatın. Protein çözeltisinin uygun hacmini protein rezervuarı içinde pipetlemek ve 5.1-5.4 adımlarında açıklandığı gibi protein örneğini kapsüllemek. Çipi 293 K’da sakla.NOT: Diyaliz yoluyla kristalizasyon, buhar difüzyon yöntemi veya toplu kristalizasyon ile yapılan deneylerden farklı bir kinetik yörünge izler ve ölçülen verilere göre difüzyon sürecinde yer alan çökelti moleküllerinin doğasına derinden bağlıdır51ve çekirdeğin başlaması daha fazla zaman alabilir. Buharlaşmayı önlemek için, varsa, bu süre zarfında, çipi 293 K’da nem doymuş bir atmosfere yerleştirin. 7. Yerinde ve çip üzerinde X-ışını kırınımı Kiriş çizgileri için 3D baskılı destek Aynı anda en fazla üç çip taşıyabilen desteği yazdırın. Desteğin boyutları, plaka X-ışını kırınım deneyleriyle uyumlu ticari kristalizasyon plakalarının (96 kuyu/SBS standardı) boyutlarıyla aynıdır.NOT: Desteğin basımı ticari hizmetlere atanabilir. Destek bir 3D-CAD tasarım yazılımı kullanılarak tasarlanmıştır ve çip üzerinde protein kristalizasyon deneyleri sırasında Şekil 3A’da ve BM30A-FIP’te (ESRF) yerinde X-ışını kırınım veri toplama sırasında Şekil 3B’de gösterilmiştir. Destekteki diyaliz çiplerini tek veya çift taraflı bir bantla sabitleyin. Yerinde X-ışını kırınımı Protein rezervuarında yetişen kristallerden oda sıcaklığında X-ışını kırınım verilerini toplayın. Örneğin, 12.656 keV enerjiye, 3.32 x 1010 foton s -1 akı ve 250 x250 μm2ışın boyutuna sahip X ışınları kullanın. 315 x 315 mm2 ve 9,4 mega piksel çözünürlükte aktif bir yüzey için 3 x 3 CCD matrisli ADSC Quantum 315r dedektörü ile kırınım görüntülerini kaydedin.NOT: Diyaliz çiplerinde yetişen lysozyme kristallerinin kırınım verileri, Avrupa Senkrotron Radyasyon Tesisi’ndeki (ESRF) BM30A-FIP ışın hattında toplanmıştı. Bununla birlikte, ışın boyutu, akı ve dedektör tipi diğer X-ışını radyasyon kaynaklarında farklı olabilir. 3D baskılı destek, kristalin etrafında -40° ila +40° açısal aralıkla veri toplamayı sağlar. Yerinde veri toplama için maruz kalan lysozyme kristallerinin sayısı, her kristal için toplanan kırınım desenlerinin sayısı, pozlama başına salınım açısı aralığı ve pozlama süresi Tablo 2’deözetlenmiştir. Veri işleme XDS programı48ile lysozyme kristalleri için kırınım desenleri ile tam veya kısmi veri kümelerini işleyin. Her veri kümesi için HKL dosyasını oluşturun ve XSCALE yazılımı48’i kullanarak ölçeklendirin. CPP4 suite49’un Fazer programı ile moleküler değiştirme kullanın ve model oluşturma aşamalarını belirleyin. Bu adım için, Protein Veri Bankası (PDB) girişi 193L’den lysozyme’ın bilinen 3D koordinatlarını kullanın. Phenix52 kullanarak yapıyı iyileştirin ve COOT50kullanarak nihai protein modelini inceleyin.

Representative Results

Junius ve ark.19,45 tarafından geliştirilen mikroakışkançipler,mikrodiyaliz yöntemi ile hem çip üzerinde protein kristalizasyonu hem de oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım verisi toplama için uyumludur. Mikroçiplerin resimleri, ayrıntılı tasarımları, akışkan konektörleri ve RC diyaliz zarı Şekil 2’degösterilmiştir. Kristalizasyon deneyleri, protein örneğini doğrudan protein rezervuarına manuel olarak borulayarak ve kristalizasyon çözeltisini otomatik basınç tahrikli bir sistem veya şırınna pompası ile doğrusal akışkan kanala sokarak veya bir şırınna yardımıyla manuel olarak ayarlanır. Protein rezervuarı ve akışkan kanal Şekil 2A’daayırt edilebilir. Protein rezervuarının maksimum hacmi 0,1 μL veya 0,3 μL olan talaşların imalatı için tasarımlar, sırasıyla sol ve sağda Şekil 2A’da gösterilmiştir. Protein örneği için 0,2 μL veya 0,7 μL maksimum kapasiteye sahip talaşlar başka bir yerde gösterilmiştir19. Cihaz imalatı için protokolün vurgulanması, çeşitli MWCO’ların ticari olarak mevcut RC diyaliz membranlarını gömen fotokür edilebilir tiyol bazlı reçine NOA 81’in kullanımına daraltılabilir. Mikroakışkan cihazların imalatı sırasında, doğrusal akışkan kanal alt PDMS kalıbına (Şekil 1F) basılırken, üst PDMS kalıbı sadece protein rezervuarı ve giriş ve çıkış bağlantı noktaları için desenli sütunlardan oluşur (Şekil 1F). NOA 81 çapraz bağlandıktan ve PDMS kalıpları montajdan çıkarıldıktan sonra (Şekil 1K), akışkan kanal mikroçip alt tabakasında bulunur ve protein kanalı ve giriş/çıkış portları her iki katmanda da bulunur. Şekil 1L, diyaliz çipinin tüm katmanlarının ve ilgili kalınlıklarının belirtildiği bir yan görünüm şemasını göstermektedir. Talaşların alt tabakasına (akışkan kanal) basılan desenlerin yüksekliği yaklaşık 45 μm iken, giriş ve çıkış bağlantı noktalarının toplam yüksekliği yaklaşık 90 μm’dir. Protein rezervuarı (45 μm yükseklik) şekil 2D ve 2E’dede gösterilmiştir. İki katmanın hizalaması optik bir mikroskop altında incelenmiştir ve mikroçip içine dahil edilen RC diyaliz zarının parçası Şekil 2D’deaçıkça ayırt edilebilir. Aynı şekilde, protein rezervuarının sol üst kısmında da görülebileceği gibi, kristalizasyon çözeltisinin enjeksiyonu sırasında hava akışkan kanala tuzaklanmıştır. Şekil 2E, protokolün 5.2 ve 5.3. Kristalizasyon deneyleri için kullanılmaya hazır mikroakışkan çip, protein örneğinin kapsüllenmesinden ve akışkan konektörlerin yapıştırılmasından sonra Şekil 2C’detasvir edilir. Hava geçirmez montaj, sızıntıların meydana gelmemesini sağlar. Mikroakışkan kanalın giriş ve çıkış bağlantı noktaları için akışkan konektörler, protokolün 4.1. adımında açıklandığı ve Şekil 2C’degösterildiği gibi piyasada bulunanlar olabilir veya tek kullanımlık laboratuvar pipet uçları aynı amaç için kullanılabilir (Şekil 2B, protokol adımı 4.4). Mikroakışkan çiplerin imalatı için, oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım deneyleri için yüksek uyumluluk gösteren optik olarak şeffaf ve biyolojik olarak inert malzemeler seçildi. Mikroakışkan cihazı oluşturan malzemeler ve çevresindeki atmosfer (hava) ile X ışınlarının, emilim ve saçılma etkileşimleri arka plan gürültüsü olarak bilinen bir sinyal oluşturur. Bu gürültü, dedektör tarafından kaydedilen protein kristallerinin kırınım sinyalini özetler, sinyal-gürültü oranını bozarak ve X-ışını kırınım veri toplama sırasında mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır. X-ışını ışınının doğrudan yolunda bulunan protein rezervuarını oluşturan malzemeler tarafından üretilen arka plan gürültüsünü değerlendirdik. Protein rezervuarı, biri mikroçip için substrat olarak kullanılan ve diğeri protein örneğinin kapsüllenmesi için kullanılan RC diyaliz zarı, Kapton bandı ve iki PMMA parçasından oluşur. PMMA’nın kalınlığı Kapton bandının kalınlığı 20 μm ve RC diyaliz zarı yaklaşık 40 μm kalınlığındadır(Şekil 1L). Bu katmanların toplam kalınlığı yaklaşık 410 μm’dir ve NOA 81 katmanı doğrudan X-ışını yolunda değildir. İmalat malzemelerinin kalınlığının yanı sıra, X-ışını saçılım elementel atom numarasıyla arttığı için yoğunlukları arka plan saçılma gürültüsünü ölçmek için de çok önemlidir. Bu nedenle, veri toplama sırasında malzeme karakterizasyonu ve protein kırınım deneyleri için hava yerine helyum akısı (ESRF’de BM30A-FIP’te sağlanan bir özellik) kullanılmıştır. Şekil 3C, Kapton bandı, RC diyaliz zarı, PMMA levhası ve bunların helyum atmosferinde montajı tarafından oluşturulan arka plan gürültüsünü göstermektedir. Her malzeme 0.98 şdalga boyundaki X ışınlarına 20 s maruz kaldı ve numune dedektörü mesafesi 200 mm idi. Deneyler, protokolün 7. X-ışını ışınının malzemelerle etkileşimlerine atfedilen dağınık halkalar Kapton bandı için 4 Å’dan daha düşük bir çözünürlükte, PMMA levhası 4-8 şarasında ve diyaliz zarı 4-5 şçözünürlük arasında ayırt edilebilir. Diyaliz çipi tarafından üretilen arka plan gürültüsü esas olarak büyük lysozyme kristallerinin yüksek çözünürlüklü kırınım verilerinin tedavisini etkilemeyen 6 Å’dan daha düşük bir çözünürlükte gözlenir. Mikroçip ve ayrı malzemeler için çözünürlüğün bir işlevi olarak arka plan saçılma yoğunluğu başka bir yerde gösterilmiştir19. Şekil 3C’desunulan ölçümde diyaliz çipi herhangi bir çözeltiden (protein veya çökemiş çözelti) boştu ve çözelti varlığının arka plan gürültüsüne katkısı ölçülmemiştir. Çipler, yerinde kırınım deneyleri için tasarlanmış 3D baskılı bir destekle (Şekil 3B) X-ray ışınının önüne monte edilmiştir19. Bununla birlikte, 96 kuyu/SBS standart kristalizasyon plakasının boyutlarına eşit boyutlara sahip aynı destek, aynı anda 3 çipe kadar tutabildiğinden, aynı anda 1 ila 3 kristalizasyon deneyi yapmak için kullanılabilir (Şekil 3A). Model çözünür proteinlerin çip üzerinde kristalleşmesi için mikroakışkan cihazların verimliliğini mikrodiyaliz yöntemi ile değerlendirmek üzere deneyler yapıldı. Akışkan kanal, protokolün 4. Şekil 4, 293 K’de 1,5 M sodyum klorür (NaCl) altında 0,1 M sodyum asetat (CH 3 COONa) pH4,0(A) ve 1 M NaCl altında yetişen lysozyme kristallerini göstermektedir, 0.1 M CH3COONa pH 4.5 ile % 30 polietilen glikol (PEG) 400 (B). Lyophilized lysozyme tozu, sırasıyla Şekil 4A ve 4B’degösterilen deneyler için ~20 mg mL-1 nihai konsantrasyonuna veya 20 mM CH3COONa pH4.2 tamponuna suda çözülmüştür. Her iki deneyde de protein örneğinin hacmi yaklaşık 0,3 μL idi ve mikroçiplerin içine gömülü RC diyaliz zarının MWCO’su 6-8 kDa aralığındadır. Şekil 3A’da gösterilen lysozyme kristalleri 1 saat, Şekil 3B’deki kristaller ise deneyin başlangıcından itibaren 30 dakika içinde büyüdü. Kristalizasyon deneyleri statik koşullar altında gerçekleştirildi. Bununla birlikte, deneylerin akan koşullar altında yürütülmesinin, mikrodiyaliz yönteminin geri döndürülebilirliğini doğrulayarak kristalizasyon koşullarını ve çalışma aşaması diyagramlarını dinamik olarak değiştirme imkanı sağladığıgösterilmiştir. Yerinde Şekil 4A’da gösterilen lysozyme kristallerinden alınan X-ışını kırınım verileri, diyaliz çiplerinin bu tür deneylere uygunluğunu göstermek için toplanmıştı. Veri toplama, protokolün 7.2.1 adımında açıklandığı gibi oda sıcaklığında BM30A-FIP kiriş hattında (ESRF) gerçekleştirildi. Mikroçipler, 3D baskılı destek (Şekil 3B) yardımıyla kiriş çizgisine monte edildi ve Tablo 1’inikinci satırında verilen koşullar altında çip üzerinde yetiştirilen iki tekli lysozyme kristalinden komple X-ışını kırınım veri setleri toplandı. Veri kümelerinin gözlemlenen yansımaları XDS48 kullanılarak işlendi, indekslendi ve entegre edildi ve moleküler değişim ve iyileştirme sırasıyla Phaser49 ve Phenix52kullanılarak gerçekleştirildi. Her bir lysozyme kristalinin tam veri kümesi ve iki veri kümesinin birleştirilmesi için kristalografik istatistikler Tablo 2’deverilmiştir. Moleküler değişim için PDB girişi 193L kullanıldı. Tek bir lysozyme kristalinden elektron yoğunluk haritaları ve iki kristalin birleştirilmiş veri kümesi sırasıyla 1.95 şve 1.85 Å’da elde edilmiştir ve Şekil 5A ve 5B’degösterilmiştir. Her iki elektron yoğunluk haritası da, oda sıcaklığında doğrudan diyaliz mikroçip üzerinde tek bir kristalden veya birden fazla kristalden yapılan yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile elde edilebilen ayrıntılı yapısal bilgileri göstererek çipleri yerinde X-ışını kristalografi çalışmaları için uyumlu hale getirir. Şekil 1: Diyaliz çipi imalatının şematik illüstrasyonu. (A) SU-8 reçinesi iki silikon gofret üzerine biriktirilir ve spin kaplıdır. (B) Fotoresistin bir fotomask aracılığıyla UV ışığı ile ışınlandıktan ve pozlanmamış parçaları geliştirdikten sonra bir SU-8 ustası edinilir. (C) PDMS SU-8 ustalarına dağıtılmıştır ve 1 saat boyunca 338 K’de kürlendikten sonra, (D) mikro desenlerin çoğaltılması ve basılmasıyla üretilen 2 PDMS kalıbı ustalardan soyulur ve (E) uygun boyuta kesilir. (F) PDMS kalıpları, iki merkezi sütun arasındaki RC diyaliz zarını içeren bir cam slayt üzerinde desteklenir. (G) 2 PDMS kalıpları daha sonra hizalanır ve bir vakum odasında ~ 30 dakika boyunca kurut edilir. (H) NOA 81 reçinesi iki kalıbın arasına dökülür ve (I) boşluğu kapilarite ile doldurur. (J) UV ışığına ilk maruz kaldıktan sonra, alt PDMS kalıbı çıkarılır ve montaj bir PMMA levhasına biriktirilir. (K) NOA 81 reçinesini tamamen polimerize etmek için ikinci UV maruziyeti takip eder ve diyaliz çipi kalan üst PDMS kalıbını çıkardıktan sonra kullanıma hazırdır. (L) Cihazın tüm katmanlarının ve ilgili kalınlıklarının belirtildiği diyaliz çipinin yan görünüm şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Çip üzerinde protein kristalizasyonu ve yerinde X-ışını kırınım deneyleri için bir RC diyaliz zarı gömen diyaliz çipleri. (A) NOA 81 mikroçipler 175 μm kalınlığında PMMA substrat üzerinde 0.1 μL (sol) ve 0.3 μL (sağ) nominal hacimli bir protein rezervuarı ile. (B) Akışkan kanalın giriş ve çıkış portlarına yapıştırılan akışkan konektörler olarak pipet uçlu mikroçipler. (C) Kristalizasyon deneyi sırasında bir mikroçip resmi. Protein örneği 175 μm kalınlığında PMMA levha ve Kapton bant parçası ile kapsüllenmiştir. Peek Nanoport konnektörleri akışkan kanalın giriş ve çıkış portları için kullanılır. (D) Kristalizasyon çözeltisinin akışkan kanal içinde dolaşımı sırasında protein rezervuarının üst görünümü. Hava, rezervuarın üst kısmında, açıkça tespit edilebilen RC diyaliz zarının hemen altında sıkışmıştır. (E) Protein örneğinin birikmesi sırasında optik mikroskop aracılığıyla diyaliz rezervuarının üstten görünümü. Protein damlacığı gömülü RC diyaliz zarın hemen üzerinde birikir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Kristalizasyon deneyleri sırasında kullanılan mikroçipler için3D baskılı destek (A) ve yerinde X-ışını kırınım deneyleri için ESRF’deki BM30A-FIP kiriş hattında X-ışını ışınının önüne monte edilen (B). (C) X ışınlarının Kapton, RC diyaliz zarı, PMMA ve diyaliz çipi (soldan sağa) ile etkileşimi ile oluşturulan arka plan gürültüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Mikrodiyaliz yöntemi ile lysozyme’nin çip üzerinde kristalizasyonu. (A) Lysozyme (~30 mg mL -1 )1,5M NaCl ve 0,1 M CH 3 COONa pH 4,0 ve (B) lysozyme (~20 mg mL-1) kristalizasyon koşullarında yetiştirilen kristaller 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5, ve PEG 400. Her iki deney de 293 K’de yapıldı. Şekil 5: Rafine lysozyme yapısının elektron yoğunluk haritaları (A) tek bir kristalden ve (B) mikrodiyaliz yoluyla çip üzerinde yetiştirilen iki kristalin birleştirilmiş veri kümesinden. Haritalar sırasıyla 1.95 şve 1.84 Å’da elde edildi ve 1φ’de konturlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Protein Protein konsantrasyonu(mg mL-1) Protein bufffer İlk konsantrasyonçökemiş çözüm MWCO of RCdiyaliz zarı(kDa) Sıcaklık(K) Lysozyme ~ 30 Su 1,5 M NaCl0,1 M CH3COONa pH 4,0 6 – 8 293 Lysozyme ~ 20 20 mM CH3COONa pH 4.2 1 M NaCl0,1 M CH3COONa pH 4,5 PEG 400 6 – 8 293 Tablo 1: Protein tamponunun bileşimi ve mikrodiyaliz yöntemi ile lysozyme’nin çip üzerinde kristalleşmesi için çökeltici çözelti. İkinci hatta sağlanan koşullarla çip üzerinde yetiştirilen lysozyme kristalleri yerinde X-ışını kırınım veri toplama için kullanılmıştır. Protein Lysozyme Lysozyme Lysozyme Kristal sayısı 1 1 2 Kırınım çerçevesi sayısı 40 30 70 Maruz kalma başına salınım (°) 1 1 Pozlama süresi (ler) 30 30 Sıcaklık (K) 293 293 293 Boşluk grubu P43212 P43212 P43212 Birim hücre parametreleri 78.86 78.86 37.8790.0 90.0 90.0 79.17 79.17 37.9590.0 90.0 90.0 78.47 78.47 37.6590.0 90.0 90.0 Çözünürlük aralığı (Å) 27.31 – 1.95(2.02 – 1.95) 27.39 – 1.96(2.03 – 1.96) 27.17 – 1.85(1.91 – 1.85) Mozaiklik (°) 0.319 0.121 Toplam yansımalar (gözlenen) 25127 (3552) 19991 (3001) Benzersiz yansımalar (gözlenen) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975) Redudancy 2.90 (2.61) 2.41 (2.27) Tamlık (%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15) Kötü I/σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7 CC(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0 R birleştirme 0.184 R-meas 0.139 0.221 0.219 R-pim 0.116 Arıtmada kullanılan yansımalar 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965) R-free için kullanılan yansımalar 864 (78) 846 (85) 1039 (96) R-work 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102) R-free 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703) Hidrojen dışı atomların sayısı 1069 1071 1096 makromoleküller 1012 1012 1012 Su 55 57 82 Ligand 2 2 2 Protein kalıntıları 131 131 131 Rms (tahviller, Å) 0.008 0.009 0.005 Rms (açılar, °) 1.17 1.26 1.05 Ramachandran tercih edildi (%) 98.43 97.64 99.21 Ramachandran’a izin verildi (%) 1.57 2.36 0.79 Ramachandran aykırıları (%) 0.00 0.00 0.00 Avegare B faktörü 34.26 28.54 24.34 Protein 33.94 28.14 23.62 Su 40.23 35.57 33.16 ligandlar 33.23 29.63 24.77 Tablo 2: Mikrodiyaliz yöntemi ile çip üzerinde yetiştirilen lysozyme kristallerinin veri toplama parametreleri, kristalografik ve arıtma istatistikleri. Parantez içinde sağlanan değerler en yüksek çözünürlüklü kabuklara karşılık gelir. Dördüncü sütun, ikinci ve üçüncü sütunun veri kümelerini birleştirdikten sonra elde edilen değerlere karşılık gelir.

Discussion

Mikrodiyaliz yöntemi ve oda sıcaklığında yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için bir mikroakışkan cihaz geliştirilmiştir. Çip üzerinde protein kristalizasyonu için mikrodiyaliz kullanmak için herhangi bir MWCO’nun RC diyaliz membranlarını entegre eden NOA 81 çipleri imal edilebilir. Nispeten yüksek X-ışını şeffaflığına sahip imalat malzemeleri kullanıldı ve çipler yerinde protein kristalografisi için uyumlu hale getirildi. Cihazın protein kristalleşmesi için bölmeyi oluşturan imalat malzemeleri (PMMA, Kapton, RC diyaliz zarı) düşük arka plan gürültüsü oluşturacak şekilde değerlendirildi. Özellikle, diyaliz çipi tarafından üretilen arka plan gürültüsü esas olarak düşük çözünürlükte (> 6 Å) gözlenir ve protein yapısının belirlenmesi için gerekli olan büyük lysozyme kristallerinin yüksek çözünürlüklü kırınım verilerinin tedavisini etkilemez. Veri toplama otomasyonu, doğrudan makromoleküler kristalografi kiriş hatlarına monte edilebilen ve aynı anda üç mikroçip taşıyabilen 3D baskılı bir destek kullanılarak yükseltilir. Bu şekilde, kırılgan protein kristallerinin manuel olarak toplanması ve manipülasyonu önlenir. Ayrıca, veri toplama oda sıcaklığında gerçekleşir, yerel protein yapısından konformasyon değişiklikleri ile ilgili olabilecek kriyoproteksiyon ihtiyacını önler2,3.

Mikrodiyalizin çip üzerinde kristal yetiştirmek için bir yöntem olarak kullanılması, kristalleşme sürecinin doğru bir şekilde izlenmesini ve kontrol edilmesine olanak tanır. Girişte tartışıldığı gibi, geleneksel protein kristalizasyon yöntemlerinin çoğu mikroakışkan cihazlar kullanılarak uygulanmıştır11,14. Bununla birlikte, diyalizin protein kristalizasyonu için avantajları henüz mikro ölçeklerde tam olarak kullanılmamıştı. Çip üzerinde mikrodiyaliz, faz diyagramlarını inceleme ve aynı protein örneği ile kristalizasyon koşullarının taranmasını ve optimizasyonunu gerçekleştirme imkanı sağlar19. Bu çalışmada sunulan prototipler için çip başına protein tüketimi 0,1 veya 0,3 μL ile sınırlıdır. İmalat protokolü birçok adım içerir, ancak basittir ve nispeten ucuz malzemelerle temiz odada tek bir günde çok sayıda cihazın (20 ila 30 çip) üretilmesini sağlar. Bununla birlikte, proteinlerin çip üzerinde kristalleşmesi, özellikle mikro ölçeklerde nükleasyonun ve kristal büyümesinin içsel stokastik doğası nedeniyle hassas bir prosedür olabilir. Yerinde X-ışını kırınım veri toplama için uygun sağlam, iyi tanımlanmış kristaller sağlayan lysozyme kristalizasyonu için iyi belirlenmiş koşulların kullanıldığı bir vaka çalışması tanımlanmıştır. Bununla birlikte, kristalizasyon ortamının çok daha karmaşık olduğu, faz diyagramlarının bilinmediği ve iyi çalışan kristalleşme koşullarının henüz iyi belirlenmediği membran proteinleri gibi daha zorlu protein hedeflerinin kullanılmasıyla zorluklar ortaya çıkabilir. Diyaliz çipi, değerli ve sık maliyetli protein örneğini elden çıkarmadan, sadece mikroakışkan kanal içindeki kristalizasyon çözeltisini değiştirerek bu zorlukları aşma ve çip üzerindeki faz diyagramlarını inceleme imkanı sunar.

Mikroakışkan cihazların çok yönlülüğü, kristalizasyon koşullarını geri dönüşümlü olarak kontrol etmek ve düşük protein hacmini kullanarak konsantrasyon ve sıcaklık çeşitli faz diyagramlarını haritalamak için çip üzerinde protein kristalizasyonu için mikrodiyalizden yararlanmaktan kaynaklanmaktadır. Ayrıca, cihaz yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile uyumludur ve cihazların prototipleme ucuz ve hızlıdır. Çözünür ve membran proteinlerinden oluşan çok sayıda izomorf kristal (hazırlık aşamasında) çip üzerinde yetiştirilebilir ve tüm bu özelliklerin senkrotron ve XFEL tesislerinde zorlu protein hedeflerinin seri X-ışını kristalografi çalışmaları için kullanılabilmesi beklenir. Son olarak, çip üzerinde ve yerinde zamanında çözülmüş çalışmalar yapmak, kristalografik topluluğun önemli ilgisini çekebilecek gelecekteki bir olasılıktır. Bu nedenle, diyaliz çipinde kristaller yetiştirerek ve reaktifleri mikroakışkan kanala manuel olarak (şırınga kullanarak) veya otomatik olarak (basınç kontrol sıvı sistemi veya şırınga pompası ile) sokarak, gelecekteki çabalar mikroakışkan çiplerin senkrotron kiriş çizgileri üzerinde zaman çözümlü deneyleri tetiklemek için başarıyla kullanılabileceğini kanıtlamaya odaklanacaktır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MBS, 2014-2015 sınırlarında Enstrümantasyon sözleşmesi kapsamında MI / CNRS’nin desteğini kabul eder. NJ, Doktora Bursu için CEA’nın Uluslararası Doktora Araştırma Programını (Irtelis) kabul eder. MBS ve SJ, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması olan 722687 kapsamında Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı’ndan fon sağladığını kabul ediyor. MBS, SJ ve NJ, mikrofabrikasyon deneyleri için temiz oda kuruluşu için LIPhy’ye (UGA) teşekkür eder. IBS, Grenoble Disiplinlerarası Araştırma Enstitüsü’ne (IRIG, CEA) entegre olduğunu kabul eder.

Materials

3 in wafer Silicon Materials Inc. Silicon wafer
Centrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
CleWin 3.0 WieWeb software Designing software
Epoxy glue Devcon 5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors Cluzeau Info Lab N-333 NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme Roche 10 837 059 001 Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554 Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS Sigma-Aldrich 440191 Silane, chemical
Hot plate Sawatec HP-200-Z-HMDS BM Hot plate
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Solvent
Kapton tape DuPont Polyimide tape
Mask aligner SUSS MicroTec MJB4 Mask aligner, UV source
Membrane filter Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide Fisher Scientific 12164682 3 x 1 in glass slides
NOA81 Norland Products Inc.  NOA81 Photocurable resin
Oven Memmert Oven
Parafilm Sigma-Aldrich P6543 Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
PEG 400 Hampton Research HR2-603 Chemical
Petri dish Sigma-Aldrich P5731 100 x 15 mm
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Plasma equipment Diener Electronic ZEPTO Plasma treatment
PMMA Goodfellow 137-745-63 PMMA sheets 150×150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system Elveflow OB1 MK3+ Pressure/vacuum controller
PTFE tubing Elveflow/Darwin microfluidics LVF-KTU-15 PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane Spectra/Por Various MWCOs
Scalpel Swann-Morton Carbon steel surgical blades
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Solidworks Dassault Systemes 3D-CAD designing software
Spin coater SPS Spin150 Wafer spinner
SU-8 3000 series MicroChem Corp. SU-8 3050 Photoresist
Syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker Uvitec CL-508 UV crosslinker
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garman, E. F. Radiation damage in macromolecular crystallography: what is it and why should we care. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 339-351 (2010).
  2. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  3. Fraser, J. S., et al. Accessing protein conformational ensembles using room-temperature X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16247-16252 (2011).
  4. Gotthard, G., et al. Specific radiation damage is a lesser concern at room temperature. IUCrJ. 6 (4), 665-680 (2019).
  5. Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 32-47 (2016).
  6. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal X-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  7. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470, 73-78 (2011).
  8. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Science Reports. 4, 6026 (2014).
  9. Pawate, A. S., et al. Towards time-resolved serial crystallography in a microfluidic device. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology Communications. 71, 823-830 (2015).
  10. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 73, 373-378 (2017).
  11. Leng, J., Salmon, J. -. B. Microfluidic crystallization. Lab on a Chip. 9, 24-34 (2009).
  12. Morel, M., Galas, J. -. C., Dahan, M., Studer, V. Concentration landscape generators for shear free dynamic chemical stimulation. Lab on a Chip. 12, 1340-1346 (2012).
  13. Miralles, V., Huerre, A., Malloggi, F., Jullien, M. -. C. A review of heating and temperature control in microfluidic systems: techniques and applications. Diagnostics. 3, 33-67 (2013).
  14. Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: from crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4, 032202 (2017).
  15. Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14431-14436 (2004).
  16. Laval, P., Lisai, N., Salmon, J. -. B., Joanicot, M. A microfluidic device based on droplet storage for screening solubility diagrams. Lab on a Chip. 7, 829-834 (2007).
  17. Shim, J. -. U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. Journal of the American Chemical Society. 129, 8825-8835 (2007).
  18. Selimovic, S., Gobeaux, F., Fraden, S. Mapping and manipulating temperature-concentration phase diagrams using microfluidics. Lab on a Chip. 10, 1696-1699 (2010).
  19. Junius, N., et al. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20, 296-310 (2020).
  20. Greaves, E. D., Manz, A. Towards on-chip X-ray analysis. Lab on a Chip. 5, 382-391 (2005).
  21. Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9, 1412-1421 (2009).
  22. Guha, S., Perry, S. L., Pawate, A. S., Kenis, P. J. A. Fabrication of X-ray compatible microfluidic platforms for protein crystallization. Sensors and Actuators B. Chemical. 174, 1-9 (2012).
  23. Sui, S., et al. Graphene-based microfluidics for serial crystallography. Lab on a Chip. 16, 3082-3096 (2016).
  24. Russo Krauss, I., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Science. 14, 11643-11691 (2013).
  25. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 70, 2-20 (2014).
  26. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A droplet-based, composite PDMS/Glass capillary microfluidic system for evaluating protein crystallization conditions by microbatch and vapor-diffusion methods with on-chip X-ray diffraction. Angewandte Chemie. 43, 2508-2511 (2004).
  27. Talreja, S., Kim, D. Y., Mirarefi, A. Y., Zukoski, C. F., Kenis, P. J. A. Screening and optimization of protein crystallization conditions through gradual evaporation using anovel crystallization platform. Journal of Applied Crystallography. 38, 988-995 (2005).
  28. Hansen, C. L., Classen, S., Berger, J. M., Quake, S. R. A microfluidic device for kinetic optimization of protein crystallization and in situ structure determination. Journal of American Chemical Society. 128, 3142-3143 (2006).
  29. Schieferstein, J. M., et al. X-ray Transparent microfluidic platforms for membrane protein crystallization with microseeds. Lab on a Chip. 18, 944-954 (2018).
  30. Ghazal, A., et al. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab on a Chip. 16, 4263-4295 (2016).
  31. Li, L., Ismagilov, R. F. Protein crystallization using microfluidic technologies based on valves, droplets, and SlipChip. Annual Review of Biophysics. 39, 139-158 (2010).
  32. Du, W., Li, L., Nichols, K. P., Ismagilov, R. F. SlipChip. Lab on a Chip. 9, 2286-2292 (2009).
  33. Zhang, S., et al. Microfluidic platform for optimization of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 472, 18-28 (2017).
  34. Abdallah, B. G., et al. Protein crystallization in an actuated microfluidic nanowell device. Crystal Growth & Design. 16, 2074-2082 (2016).
  35. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 406-412 (2019).
  36. de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6, 454-464 (2019).
  37. Shim, J. -. U., Cristobal, G., Link, D. R., Thorsen, T., Fraden, S. Using microfluidics to decouple nucleation and growth of protein crystals. Crystal Growth & Design. 7, 2192-2194 (2007).
  38. de Jong, J., Lammertink, R. G. H., Wessling, M. Membranes and microfluidics: a review. Lab on a Chip. 6, 1125-1139 (2006).
  39. Paustian, J. S., Nery Azevedo, R., Lundin, S. T. B., Gilkey, M. J., Squires, T. M. Microfluidic microdialysis: spatiotemporal control over solution microenvironments using integrated hydrogel membrane microwindows. Physical Review X. 3, 041010 (2013).
  40. Kornreich, M., Heymann, M., Fraden, S., Beck, R. Cross polarization compatible dialysis chip. Lab on a Chip. 14, 3700-3704 (2014).
  41. Song, S., Singh, A. K., Shepodd, T. J., Kirby, B. J. Microchip dialysis of proteins using in situ photopatterned nanoporous polymer membranes. Analytical Chemistry. 76, 2367-2373 (2004).
  42. Skou, M., Skou, S., Jensen, T. G., Vestergaard, B., Gillilan, R. E. In situ microfluidic dialysis for biological small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47, 1355-1366 (2014).
  43. Zou, L., et al. A multistage dialysis microdevice for extraction of cryoprotectants. Biomedical Microdevices. 19, 30 (2017).
  44. Satya Eswari, J., Naik, S. A critical analysis on various technologies and functionalized materials for manufacturing dialysis membranes. Materials Science for Energy Technologies. 3, 116-126 (2020).
  45. Spano, M., Salmon, J. -. B., Junius, N. FR3044685A1. UJF. , (2015).
  46. Bartolo, D., Degre, G., Nghe, P., Studer, V. Microfluidic stickers. Lab on a Chip. 8, 274-279 (2008).
  47. Junius, N., et al. A crystallization apparatus for temperature controlled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
  48. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 125-132 (2010).
  49. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and developments of COOT. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  51. Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semipermeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20, 3927-3936 (2020).
  52. Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
  53. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28, 153-184 (1998).
  54. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
  55. Baxter, E. L., et al. High-density grids for efficient data collection from multiple crystals. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 72, 2-11 (2016).
  56. Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An all-in-one sample holder for macromolecular X-ray crystallography with minimal background scattering. Journal of Visualized Experiments. (149), e59722 (2019).

Tags

Protein CrystallizationMicrofluidic ChipsDialysisIn Situ X-ray DiffractionPDMSSU8 MasterRegenerated Cellulose Dialysis MembraneProtein Sample VolumeCrystallization ConditionsNucleationCrystal GrowthPhase Diagrams

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image