JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Кристаллизация белков на чипе с помощью микродиализа для рентгеновских исследований In Situ

Published: April 11, 2021
doi:
10.3791/61660
, , , , ,
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258,Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

Summary

В этой статье подробно измышления протокола микрофлюидных чипов, разработанных для кристаллизации белка на чипе с помощью метода диализа и экспериментов по рентгеновской дифракции на месте. Процесс микрофабрикации позволяет интегрировать полупроницаемую регенерируемую целлюлозную диализную мембрану с любым молекулярным вырезом веса, между двумя слоями чипа.

Abstract

Этот протокол описывает изготовление воспроизводимых и недорогих микрофлюидных устройств, охватывающих весь трубопровод для кристаллизации белков на чипе с помощью метода диализа и позволяющих на месте однокристаллических или серийных экспериментов кристаллографии при комнатной температуре. Протокол подробно процесс изготовления микрочипов, манипуляции на чипе кристаллизации экспериментов и лечения на месте собраны рентгеновские данные дифракции для структурного выяснения образца белка. Основная особенность этой процедуры микрофабрикации заключается в интеграции коммерчески доступной, полупроницаемой регенерируемой целлюлозной диализной мембраны между двумя слоями чипа. Молекулярное снижение веса встроенной мембраны варьируется в зависимости от молекулярного веса макромолекулы и обрывов. Устройство использует преимущества микрофлюидной технологии, такие как использование мельчайших объемов образцов (<1 МЛ) и тонкая настройка транспортных явлений. Чип соединил их с методом диализа, обеспечивая точный и обратимый контроль над процессом кристаллизации и может быть использован для исследования фазовых диаграмм белков в масштабе микролитеров. Устройство узорчато с использованием фотокурируемой смолы на основе тиолена с мягкой литографией отпечатков на оптически прозрачном полимерном субстрате. Кроме того, было оценено фоновое рассеяние материалов, сочиняющих микрочипы и генерирующих фоновый шум, что сделало чип совместимым для экспериментов по рентгеновской дифракции на месте. После того, как кристаллы белка выращиваются на чипе до адекватного размера и однородности популяции, микрочипы могут быть установлены непосредственно перед рентгеновским лучом с помощью 3D печатного держателя. Этот подход решает проблемы, связанные с использованием криопротекторов и ручной уборки в обычных экспериментах по кристаллографии белка простым и недорогим способом. Полные рентгеновские наборы данных дифракции из нескольких, изоморфных кристаллов лизозима, выращенных на чипе, были собраны при комнатной температуре для определения структуры.

Introduction

Выяснение трехмерной (3D) структуры биологических макромолекул является непрекращающейся погоней в структурной биологии, где рентгеновская кристаллография остается основным методом исследования. Применяется для распутывания структурных деталей сложных макромолекул, таких как белки, он направлен на облегчение понимания их механизмов действий и их участия в различных биологических функций. Мощные рентгеновские источники на синхротронах и рентгеновских свободно-электронных лазерах (XFELs) обеспечивают все инструменты, необходимые для более глубокого понимания структуры белков при почти атомном разрешении. Несмотря на преимущества, которые приходят вместе с использованием рентгеновских лучей для структурных исследований, Есть внутренние ограничения рентгеновского излучения и сам процесс кристаллизации. Радиационное повреждение, спровоцированное высоким рентгеновским потоком и длительной экспозицией кристалла белка перед рентгеновским лучом, является ограничительными параметрами, которые кристаллографы должны превзойти с помощью криогенногоохлаждения 1. Тем не менее, найти оптимальные условия криоколя может быть трудоемким, поскольку конформациальные изменения от родной структуры белка илиартефакты могут быть скрыты 2,3. Кроме того, последние исследования показывают, что выполнение дифракционных экспериментов при комнатной температуре приводит к снижению специфического радиационногоповреждения 4. Еще одним узким местом в структурной биологии является приобретение хорошо диффрактинг кристаллов с достаточным размером5. Маленькие кристаллы легче производить, особенно в случае мембранных белков, но более восприимчивы к повреждению излучения даже в условиях криоколя, потому что высокая доза излучения должна быть направлена в меньшем объеме по сравнению с более крупными кристалламибелка 6. Новый подход серийной кристаллографии7,8 на синхротронах и XFELs может обойти ограничения радиационного повреждения и в то же время использовать меньшие кристаллы (200 нм до 2 мкм)7 путем слияния наборов данных из нескольких, изоморфные и случайно ориентированные кристаллы белка и прибыль от связанных технологических достижений, таких как фемтосекундные импульсы, более короткие сроки экспозиции и микро-ориентированныерентгеновские лучи 5,7,9,10.

Микрофлюидная технология ценна для рентгеновской кристаллографии, экспонирование многообразных преимуществ для кристаллизации биологических макромолекул и их структурных исследований. Проведение экспериментов по кристаллизации микрофлюидных устройств требует небольших объемов образца белка, что ограничивает производственные затраты этих высоко ценимых био макромолекул и облегчает высокопрофильную скрининг и оптимизацию многочисленных условий кристаллизации. Кроме того, присущее большой площади поверхности к объему соотношение в микрофлюидной шкале и диффузии ограниченных транспортных явлений позволяют тонкий контроль надпотоками и температуры или концентрации градиентов 11,12,13,14, оказание микрофлюидныхустройств,пригодных для выращивания равномерно размера кристаллов и изучения фазовых диаграмм15,16,17,18,19. Кроме того, микрофлюидные инструменты отображают отличительный потенциал для решения еще одного препятствия в кристаллографии белка, который является доставка образца, и необходимость обработки и сбора кристаллов белка до их использования для рентгеновских экспериментов дифракции. Метод рентгеновской кристаллографии на чипе и на месте устраняет манипуляции с кристаллами и потенциальное ухудшение качества кристалла до сбора данных. Широкий спектр микрофлюидных чипов, совместимых для кристаллографии рентгеновского белка in situ, был разработан, разработан и протестирован многими исследовательскими группами, сталкиваясь с сопутствующими ограничениями, вытекающими из природы материалов микрофабрикации и их взаимодействия с рентгеновскимилучами 14,19,20,21,22,23. Производственные материалы должны быть оптически прозрачными, биологически инертными и демонстрировать высокую прозрачность рентгеновского излучения и оптимальное соотношение сигнала к шуму при сборе данных.

Большинство методов кристаллизации, применяемых в обычнойкристаллографии белка 24,25 также были реализованы в микрофлюиднойшкале 11,14 для кристаллизации чипа и на месте рентгеновского дифракции анализа. Простой, гибридный, или многослойный микрофлюидныйаппарат, включающий диффузию пара 26,испарение 27,свободное диффузию интерфейса (FID)28,микробатч26,или даже посев 29 были использованы для кристаллизации растворимых и мембранных белков. Высокая пропускная способность скрининга и оптимизации условийкристаллизации может быть достигнуто 30,31 вхорошо основе 32, капли наоснове 33, или клапан-активированных34 устройств. На месте Рентгеновские дифракционные эксперименты сложных целей белка при комнатной температуре были проведены в микрочипах, изготовленных из различных материалов, таких как PDMS (полидиметилсилоксан), COC (циклический олефин кополимер), PMMA (поли (метилметакрилат))21,2 2,26,28,29, графеновые пленки23, Kapton35, эпоксидный клей6, или NOA (Норланд оптическийклей) 19 и прозрачность материалов рентгеновского излучения и их вклад в фоновый шум были оценены. Кроме того, микрочипы были разработаны, чтобы работать на месте и серийные стратегии сбора данных в единый инструмент для рентгеновских экспериментов кристаллографии белкана синхротронных источников 23,35,36 и XFELs7.

Сбор данных о комнатной температуре на месте также осуществляется в различных методах доставки и устройствах. Например, Nogly et al.54 использовали инжектор липидной кубической фазы (LCP) для изучения структуры светового фотона насоса bacteriorhodopsin (bR) с помощью серийной фемтосекундной кристаллографии (SFX) с помощью источника XFEL. Кристаллическая структура bR была решена до разрешения 2.3, демонстрируя совместимость инжектора LCP с последовательной фемтосекундной кристаллографией (TR-SFX). Компания «Бакстер идр. 55» разработала многокристаллическое сетку высокой плотности, изготовленную из поликарбонатного пластика толщиной 100 или 200 мкм с лазерными отверстиями различных размеров. Дополнительная поликарбонатная пленка толщиной 5 мкм может быть закреплена на одной стороне сетки при использовании устройства для экспериментов по кристаллизации сидячей или подвесной капли. Эта сетка высокой плотности может быть использована несколькими способами, так как кристаллы могут быть загружены непосредственно в порты устройства или кристаллы могут быть выращены на устройстве путем диффузии пара или метода LCP. Кроме того, сетка может быть отрегулирована в стандартной магнитной базе и использоваться для сбора рентгеновских данных на месте в криогенных или комнатных температурных условиях. Совсем недавно компания Feiler et al.56 разработала держатель образца макромолекулярной рентгеновской кристаллографии на месте при криогенной и окружающей температуре с минимальным вкладом фонового шума. В частности, держатель состоит из пластиковой опоры, прозрачной фольги COC и микропорной структурированной полиимидной фольги. Он был разработан, чтобы заменить широко используемые слайды покрытия для настройки кристаллизации капель, позволяя на месте манипуляции, такие как лиганд замачивания, комплексное образование, и криогенной защиты без открытия кристаллизации падение или вручную обработки кристаллов. Кроме того, держатель образца может быть удален из кристаллизующей пластины и помещен на магнитную основу для сбора данных на месте на стандартных гониометровых лучах. Для сбора данных о температуре окружающей среды фольга COC удаляется до начала эксперимента, и только полиимидная фольга толщиной 21 мкм способствует рассеянию фона, которое в данном случае является минимальным. Эти примеры составляют лишь малую часть текущих исследований и множество универсальных микрочипов, разработанных для рентгеновской кристаллографии белка.

Тем не менее, метод кристаллизации белка диализа не был широко включен в микрофлюиду. Диализ является методом на основе диффузии, направленным на эквилибровку стремительной концентрации через полупроницаемую мембрану, чтобы приблизиться к номинальной концентрации кристаллизации белка и обеспечивает точный и обратимый контроль над условиями кристаллизации24. Молекулярный вес Cut-Off (MWCO) полупроницаемой мембраны диализа могут быть выбраны в зависимости от молекулярного веса макромолекулы и обрывисты, чтобы диффузии малых осадков молекул при сохранении макромолекулы интереса. Из-за обратимости процесса диализа, он может быть использован в сочетании с контролем температуры для разъединения и оптимизации нуклеациии роста кристалла независимо 37 для исследования фазовых диаграмм путем изменения концентрации осадков при использовании того же образца белка. Интеграция мембран в микрофлюиду рассматривается de Jong et al.38 и тематические исследования в биологии имплантации диализа в микрочипы могут быть главным образом перечислены в подготовке образца, концентрации или фильтрацииприложений 39,40,41,42 или связанных склетками исследований 43,44. Первапорация через PDMS была использована Shim et al.37 для изучения нуклеации и роста ксиланазы в различных условиях. Вода пронизыла мембрану PDMS толщиной 15 мкм в белковый резервуар микрофлюидного устройства, впоследствии изменив белок и пропасть концентрации.

Представлен протокол, разработанный Junius et al.19,45 для изготовления микрофлюидного чипа, совместимого как для кристаллизации белка на чипе с помощью микродиализа, так и для экспериментов по рентгеновской дифракции на месте при комнатной температуре. Протокол для изготовления устройства непосредственно вдохновлен новаторской работы, выполненной Studer иколлегами 12,46 для микро-узорные наклейки фото-излечимой тиоленовой основе смолы NOA 81 встраивания коммерчески доступных мембран, используя мягкий отпечаток литографии. Инновационная модификация метода привела к появлению микрочипов, позволяющих использовать микродиализ для точного мониторинга и контроля экспериментальных параметров роста кристаллов белка на чипе и одновременно использовать преимущества микрофлюиды, такие как снижение потребления белковых образцов в ходе эксперимента (20 МЛ) для скрининга и оптимизации условий кристаллизации путем картирования температурно-обрывистых диаграмм фазы концентрации,были продемонстрированы 47. В этой работе описывается протокол для производства микрочипов диализа, включающих регенерированные целлюлозные (RC) диализные мембраны различных MWCO для выполнения анализов кристаллизации на чипе и на месте рентгеновского сбора данных дифракции. Материалы, состоящие из микрочипов, были оценены на прозрачностьрентгеновских лучей 19 и устройства могут быть установлены непосредственно перед рентгеновским лучом для комнатной температуры на месте дифракции экспериментов, за исключением ручной обработки и минимизации деградации хрупких кристаллов белка. В случае исследования, курица яично-белые кристаллы лизозима были выращены на чипе с помощью микродиализа генерации равномерно размера населения. Микрочип был установлен перед рентгеновским лучом с 3D-печатной поддержкой19 и полные наборы данных дифракции на месте были собраны при комнатной температуре из нескольких, изоморфных кристаллов, демонстрируя высокий потенциал и актуальность чипов для синхротронных серийных кристаллических исследований сложных макромолекулярных целей.

Protocol

1. Маска дизайн и мастер изготовления Нарисуйте желаемую геометрию микрофлюидного устройства с помощью любого векторного программного обеспечения для рисования. Для каждого слоя фоторезист, который будет использоваться для следующего шага фотолитографии, подготовьте индивидуальную маску: одну маску с каналами и столбами и одну маску, содержащую только столбы. Перевестите файлы CIF, генерируемые программным обеспечением для рисования, в фотомаски фильмов. Это можно сделать через коммерческие услуги. Требуется соответствующая фотомаска в зависимости от выбора фоторезистки, используемой во время фотолитографии.ПРИМЕЧАНИЕ: Для фоторезистер Су-8 закажите маски с черными чертами на прозрачном фоне. СУ-8 является эпоксидной основе отрицательного фоторезистаста, а это означает, что во время воздействия УФ-излучения (365 нм) части подвергаются УФ пересекаются в то время как остальные остаются растворимыми. Таким образом, все черные узоры на маске не будут связаны ультрафиолетовым светом во время фотолитографии. Каналы и столбы будут выгравированы на мастерах. Подготовь два мастера на кремниевых пластинах для дизайна каждого чипа с помощью фотолитографии с помощью отрицательного фоторезистера СУ-8.ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.3.1-1.3.7 выполняются в чистой комнате. Описанные ниже шаги являются традиционными этапами фотолитографии, за которыми следует мягкая литография PDMS, которые описаны во многих учебниках. Все значения экспериментальных параметров (фоторезистер, продолжительность времени, температура и т.д.) зависят от многих тонких параметров и должны быть оптимизированы в зависимости от используемого аппарата. Используйте 3-дюймовую кремниевую пластину и обработать поверхность плазмой на 90 с, чтобы облегчить осаждение и крепление фоторезистаса СУ-8. Налейте около 3 мл СУ-8 сопротивляться на середине пластины и спина пальто СУ-8 до желаемой толщины(рисунок 1A). Для номинальной толщины 50 мкм используйте СУ-8 3050 и спиновое покрытие по 10 с при 500 об/мин и последовательно по 30 с при 3500 об/мин. Мягкий выпекать фоторезист на горячей тарелке в течение 15 минут при 368 K для того, чтобы быть частично затвердевания, позволяя растворитель, содержащийся в смоле испаряться и предотвратить его от прилипания на фотомаске. После этого оставьте при комнатной температуре на 2 мин. Разоблачить фоторезистер к ультрафиолетовомусвету (рисунок 1B). Используйте выравниватель маски с мощностью 35 мВт см-2 и 8 с время экспозиции. Продолжить после экспозиции выпечки. Поместите пластину на горячую тарелку в течение 5 минут при 368 K, чтобы завершить фотореакцию, вызванную УФ-облучением. Удалите все SU-8 сопротивляться, что не был перекрестный путем размещения в ванне, содержащей пропиленгликоль метил эфир ацетат (PGMEA) и перемешать в течение 15 минут. Промыть с изопропанолом, пока не размытые осадки не могут наблюдаться. Высушите азотным газом и храните ее в чашке Петри (100 мм х 15 мм стандартного размера). Лечить поверхность пластины с силаном для того, чтобы облегчить отслоение полидиметилсилоксана (PDMS), который будет использоваться для изготовления 2 марок. Депозит на постучал горячей пластины на 368 K в течение 10 минут под паровой атмосфере hexamethyldisilazane (HMDS).ПРИМЕЧАНИЕ: Если отслаивания PDMS от становится трудно после нескольких применений, поверхность пластины должны быть обработаны снова с паром HMDS. Первый мастер, содержащий каналы и столбы, готов. Повторите эти шаги и подготовьте второй мастер шаблон только столбы.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время фотолитографии, цель состоит в том, чтобы получить геометрию устройства на Су-8 мастеров с высотой 50 мкм. Однако, как только два мастера Су-8 будут изготовлены, измерьте высоту геометрий, выгравированных на мастерах с помощью профилометра, чтобы приобрести экспериментальную ценность. Измеренное значение для обоих мастеров СУ-8, изготовленных для этого протокола, составляет примерно 45 мкм. 2. PDMS формы изготовления ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги протокола могут быть выполнены в любой лаборатории до тех пор, как ламинарный поток капот используется, желтый свет в комнате используется при работе с смолой NOA 81 (шаги 3,6-3,11) и источник УФ-излучения доступен для полимеризации смолы NOA 81 (шаги 3,7 и 3,11). Приготовьте 50 г силиконовой базы PDMS и ее лечебного средства в соотношении масс 10:1. Смешайте оба ингредиента в стакане с шпателем и поместите смесь в вакуумную камеру, чтобы удалить все пузырьки воздуха. Налейте 25 г предварительно смешанной PDMS в СУ-8 мастер (хранится в чашке Петри) узор каналов и столбов до высоты около 5 мм. Налейте оставшиеся 25 г PDMS во второй СУ-8 мастер узором только столбы до высоты около 5 мм(рисунок 1C). Поместите обе чашки Петри в духовку и вылечить PDMS слоев на 338 K за 1 ч. Вырезать вылечить PDMS слой вокруг моделей СУ-8 мастеров скальпелем и аккуратно снять формы PDMS от мастеров(рисунок 1D).ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура, описанная выше, называется реплики литья, часто используется для подготовки форм PDMS, которые будут прикреплены к стеклянным поверхностям и быть частью микрофлюидногоустройства 53. В этом протоколе формы PDMS не являются частью чипа, но они используются в качестве промежуточных для изготовления чипа. Для каждой конструкции, 2 формы PDMS подготовлены от соответствующих мастеров SU-8(рисунки 1D и 1E) и будут использоваться соответственно (как описано ниже) для изготовления микрочипа. 3. Изготовление чипов диализа Поместите форму PDMS, узоря как каналы, так и столбы, на жесткую стеклянную горку микроскопа (3 x 1 в стандартном размере) с узорами, обращенныевверх (рисунок 1F). Центральный столб, соответствующий белковому резервуару, превышает вертикально на 45 мкм от горизонтальной поверхности формы PDMS. Вырезать и отделить сухой кусок регенерированных целлюлозы (RC) диализной мембраны и отложить его на центральном столбе формы PDMS, которая поддерживается на стеклянной горке(рисунок 1F).ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана диализа RC коммерчески доступна, и молекулярное отрезание веса (MWCO) выбрано соответственно с молекулярным весом протеина под изучением и precipitants используемых. Размер части мембраны диализа RC зависит от конструкции чипа. В этом протоколе разработаны 2 прототипа, где объем белкового резервуара составляет 0,1 или 0,3 мл. В этих случаях размер мембраны диализа составляет 2 х 2мм 2 или 4 х4 мм 2,соответственно. Поместите второй PDMS формы узор только столбы, стоящие вниз на верхней части формы PDMS поддерживается на стеклянной горке (Рисунок 1F). Центральный столп этой формы соответствует белковому резервуару и превышает вертикально (лицом вниз) на 45 мкм от горизонтальной поверхности. Выровнять центральные столбы 2 форм PDMS. Мембрана диализа RC «зажата» между 2 прессформами PDMS(рисунок 1G).ПРИМЕЧАНИЕ: Выравнивание между микроструктурами 2 форм PDMS может быть выполнено визуально, без какого-либо дополнительного оборудования. В противном случае, эта манипуляция может быть достигнута под микроскопом. Небольшой сдвиг между резервуарами не является проблематичным, до тех пор, пока жидкий канал и точки ввода или вывода не полностью покрыты. Высасывьте сборку в течение 30 минут в вакуумной камере, чтобы удалить все захваченные пузырьки воздуха в формы PDMS и содействовать вставке смолы на следующем этапе изготовления.ПРИМЕЧАНИЕ: 2 формы PDMS хранятся на месте PDMS-PDMS адгезии и никакого дополнительного давления или другого способа временного склеивания не требуется. Заполните пустое пространство между 2 форм PDMS с фотосовпаемой, тиоленовой основе смолы NOA 81 капиллярной впитываемой(рисунок 1H и 1I). Лечить смолу путем воздействия УФ-излучения (365 нм) для 8 с с помощью коллимированной УФ-лампы (мощность 35 мВтсм -2).ПРИМЕЧАНИЕ: Это первое воздействие позволяет NOA 81 смолы, чтобы быть частично взаимосвязаны, поскольку тонкий слой NOA 81 в контакте с формами PDMS с обеих сторон остается незамеченной. Вырезать избыток NOA 81 от внешних сторон форм PDMS с скальпелем. Удалите верхнюю форму PDMS с частично перекрестным NOA 81 застрял на нем из нижней формы PDMS и стеклянной горки. Вырежьте лист PMMA толщиной 175 мкм в стандартных размерах стеклянной горки микроскопа (3 х 1 дюйм) и снимите пластиковые защитные листы с каждой стороны части PMMA. Аккуратно нажмите на сборку верхней формы PDMS и частично вылеченный NOA 81 на кусок PMMA(рисунок 1J). Лечить снова NOA 81 путем воздействия УФ-излучения на 60 с и удалить верхнюю форму PDMS(рисунок 1K). Смола придерживается субстрата PMMA без дальнейшего лечения.ПРИМЕЧАНИЕ: ФОРМы PDMS могут быть повторно использованы примерно до 5 раз после мытья их изопропанолом и ацетоном, до тех пор, пока формы не согнуты. Мембрана диализа RC включена в наклейку NOA 81, и никаких дальнейших манипуляций или механического зажима не требуется. 4. Текучие разъемы ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция микрофлюидного чипа состоит из линейного жидкого канала для раствора кристаллизации и центрального резервуара для образца белка (белкового резервуара), оба показаны с первого взгляда двух микрочипов на рисунке 2A. Мембрана диализа RC встроена между этими двумя микроструктурами(рисунок 2D)и процесс кристаллизации развивается, в то время как осадки из раствора кристаллизации рассеиваются по мембране из-за градиента концентрации между двумя отсеками чипа, которые разделены мембраной. Микрофлюидный канал запечатлен на нижней форме PDMS(рисунок 1F). После завершения протокола изготовления чипов линейный канал расположен на нижнем слое наклейки NOA 81 в контакте с субстратом PMMA, как показано на рисунке 1K. Вход и точка доступа к выходу для решения кристаллизации расположены на каждом конце линейного канала и выглядят как отверстия (общая высота 90 мкм), как видно на рисунке 2A. Для обработки решения кристаллизации, разъемы должны быть добавлены в точках доступа. Разъемы облигаций, которые являются коммерчески доступными (NanoPort) на входе и выходе микрофлюидного канала с быстрым эпоксидным клеем(рисунок 2C). Выберите соответствующий диаметр труб PTFE в зависимости от размера разъемов. Трубки PTFE будут использоваться для введения раствора кристаллизации в жидком канале чипа.ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные комплекты рекомендуются для легкого и точного контроля над скоростью потока и, как правило, в сочетании с автоматизированными системами управления давлением или потоком (шприц-насосы) для смешивания и обработки жидкости. Тем не менее, раствор кристаллизации может быть введен вручную в линейный канал с одноразовым пластиковым шприцем. В этом случае предлагается шаг от 4,3 до 4,5. Заполните одноразовый шприц 1 мл раствором кристаллизации. Для микросхем, представленных в этом протоколе, достаточно 400 МКЛ, чтобы заполнить весь жидкий канал. Вырежьте два наконечника пипетки так, чтобы диаметр кончика с одной стороны был равен внутреннему диаметру трубки PTFE, которая будет использоваться для обработки раствора. Клей обрезанные советы на точках доступа канала с быстрой эпоксидной клея (Рисунок 2B). Соедините шприц с обрезанными наконечниками с куском трубки PTFE соответствующего размера и ввести раствор в канале, постоянно толкая шприц поршень медленно. 5. Инкапсуляция протеина ПРИМЕЧАНИЕ: Структура чипа, предназначенного для использования в качестве резервуара белка остается до сих пор открыты для атмосферы. В следующем протоколе предлагается тщательно ограничить образец белка в микрофлюидной чипе. Вручную пипетку капли образца белка внутри белкового резервуара, расположенного прямо на мембране диализа RC, как показано на рисунке 2E. Объем образца белка варьируется в зависимости от конструкции чипа и может быть 0,1 или 0,3 МЛ. Нанесите тонкий слой высокопрочных силиконовых смазок по всему белковому резервуару. Вырежьте небольшой кусочек листа PMMA толщиной 175 мкм и аккуратно поместите его над тонким слоем силиконовой смазки. Кусок PMMA должен покрывать всю поверхность белкового резервуара, где откладывается белковый раствор.ПРИМЕЧАНИЕ: Силиконовая смазка используется для повышения герметичности и предотвращения распространения белковой капли. Между кусок PMMA, используемый для покрытия белкового резервуара, и наклейкой NOA 81 не существует связи или уплотнения. Контакт между ними является твердым / твердый интерфейс. Для того, чтобы произвести общую герметику и герметивную инкапсуляцию образца белка, используется часть ленты Kapton, описанная в шаге 5.4.ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда бывает трудно ограничить образец белка в выделенной полости устройства (белковый резервуар), когда система, основанная на давлении, используется для введения раствора кристаллизации в жидком канале (шаг 6.4). Чтобы избежать упомянутой выше проблемы, следует поддерживать относительно низкие значения давления при распространении раствора кристаллизации. Давление впрыска 20-60 мбар для акальных растворов или 50-150 мбар для более вязких растворов (PEGs, глицерол)предлагается 19. Вырезать кусок ленты Kapton (20 мкм толщиной) достаточно большой, чтобы покрыть PMMA кусок, установленный над резервуаром белка и придерживаться на чипе NOA по всем краям. Образец белка инкапсулирован в резервуаре и чип готов к использованию для эксперимента кристаллизации, как показано на рисунке 2C.ПРИМЕЧАНИЕ: Чипы могут быть повторно использованы в несколько раз до тех пор, пока диализная мембрана и адгезия NOA на субстрате PMMA не ухудшаются. Если эти части чипа повреждены, наблюдаются утечки, проверяющие, что устройство больше не может быть использовано. Мытье чипов зависит от решения кристаллизации. В случае растворов низкой вязкости (соли, буферы), жидкий канал можно промыть, просто введя дистиллированную воду и дайте ей течь в течение нескольких минут. 400 йл — это объем, необходимый для полного обмена раствора в канале с другим решением. В случае более вязких растворов (PEGs, глицерол), повторное использовать чипсы не рекомендуется, так как промыть канал только водой недостаточно. Верхняя часть чипа, где находится белковый резервуар, также может быть промыта дистиллированной водой и высушена под давлением воздуха. 6. Кристаллизация белка на чипе Взвешивать лиофилизированный куриный яично-белый лизозимный порошок и растворять в дистиллированной воде, чтобы получить окончательную концентрацию 30 мгмл -1. Фильтровать белковый раствор через фильтр 0,22 мкм и центрифугу в течение 5 минут с максимальной скоростью 293 K, чтобы удалить все твердые частицы. Используйте супернатант для эксперимента по кристаллизации. Подготовь 500 МКЛ раствора кристаллизации, содержащего буфер и осадку в концентрациях, предусмотренных в таблице 1. Отфильтруйтесь раствор через фильтр 0,22 мкм. Ввести раствор в точку введения чипа шприцем или автоматизированной жидкостной системой, управляемой давлением, или шприц-насосом, как описано в шагах 4.1-4.5.ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент по кристаллизации может произойти либо в статическом состоянии, если микрофлюидный канал заполнен раствором кристаллизации и отложен, либо в условиях течения, если он непрерывно вводится внутри канала с постоянной скоростью потока. В последнем случае рекомендуется использование внешней системы, управляемой давлением, или шприц-насоса. Реализация эксперимента в условиях течения также дает возможность динамического обмена кристаллизуемых растворов в жидком канале. Таким образом, несколько экспериментов могут быть проведены при использовании одного и того же образца белка. После того, как жидкий канал заполнен раствором кристаллизации, запечатать вход и выход порты чипа с парафильмовой лентой. Pipette соответствующий объем белкового раствора в белковом резервуаре и инкапсулировать образец белка, как описано в шагах 5.1-5.4. Храните чип по 293 К.ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллизация с помощью диализа следует другой кинетической траектории от экспериментов, проведенных с методом диффузии пара или кристаллизации партии и глубоко зависит от природы осадкообразных молекул, участвующих в процессе диффузии, в соответствии сизмеренными данными 51, и это может занять больше времени для нуклеации, чтобы начать. Для предотвращения испарения, если таковые имеются, в этот период поместите чип в насыщенную влажностью атмосферу на 293 К. 7. На месте и на чипе рентгеновской дифракции 3D печатная поддержка бало лучей Печать поддержки, которая может перевозить до трех фишек одновременно. Размеры поддержки такие же, как размеры коммерческих кристаллизуумных пластин (стандарт 96 хорошо/SBS), совместимых с экспериментами рентгеновской дифракции пластин.ПРИМЕЧАНИЕ: Печать поддержки может быть назначена коммерческим службам. Поддержка была разработана с использованием программного обеспечения для проектирования 3D-CAD и показана на рисунке 3A во время экспериментов по кристаллизации белка на чипе и на рисунке 3B во время сбора данных о дифракции на месте в BM30A-FIP (ESRF). Стабилизация диализных чипов на опоре одно- или двухсторонней лентой. На месте дифракция рентгеновских лучей Сбор рентгеновских данных дифракции при комнатной температуре из кристаллов, выращенных в белковом резервуаре. Например, используйте рентгеновские лучи с энергией 12,656 кв, поток 3,32 х10 10 фотонов с -1 и луч размером 250 х 250мкм 2. Запись дифракции изображения с детектором ADSC Квантовая 315r с матрицей 3 х 3 CCD для активной поверхности 315 х 315 мм2 и 9,4 мега пикселей резолюции.ПРИМЕЧАНИЕ: Данные дифракции кристаллов лизозима, выращенных на диализных чипах, были собраны в луче BM30A-FIP в Европейском синхротронном радиационном центре (ESRF). Однако размер луча, поток и тип детектора могут отличаться в других источниках рентгеновского излучения. 3D-печатная поддержка позволяет сбор данных с угловым диапазоном от -40 до -40 “вокруг кристалла. Количество кристаллов лизозима, выставленных для сбора данных на месте, количество шаблонов дифракции, собранных для каждого кристалла, диапазон угла колебаний на экспозицию и время экспозиции суммируются в таблице 2. Обработка данных Обработать полные или частичные наборы данных с шаблонами дифракции для кристаллов лизозима с помощью программы XDS48. Создайте файл HKL для каждого набора данных и масштабировать их с помощью программного обеспечения XSCALE48. Используйте молекулярную замену с программой Phaser CPP4 Suite49 и определите фазы для построения модели. Для этого используйте известные 3D координаты лизозима из вступления Protein Data Bank (PDB) 193L. Уточните структуру с помощью Phenix52 и проинспектировать окончательную модель белка с помощью COOT50.

Representative Results

Микрофлюидные чипы, разработанные Junius et al.19,45, совместимы как для кристаллизации белка на чипе с помощью метода микродиализа, так и для сбора данных о рентгеновской дифракции на месте при комнатной температуре. Фотографии микрочипов, их детальный дизайн, жидкие разъемы и мембрана диализа RC иллюстрируются на рисунке 2. Эксперименты по кристаллизации устанавливаются путем ручного прокачки образца белка непосредственно в резервуар белка и введения раствора кристаллизации в линейный жидкостный канал с автоматизированной системой давления или шприц-насосом или вручную с помощью шприца. Белковый резервуар и жидкий канал можно выделить на рисунке 2A. Конструкции для изготовления чипов с максимальным объемом белка 0,1 мл или 0,3 МЛ показаны на рисунке 2A слева и справа соответственно. Чипы с максимальной емкостью 0,2 мл или 0,7 МКЛ для образца белка показаны в другом месте19. Изюминка протокола для изготовления устройства может быть сужена на использовании фотокурируемой тиоленовой смолы NOA 81, встраивающих коммерчески доступные мембраны диализа RC различных MWCOs. Во время изготовления микрофлюидных устройств, линейный жидкий канал запечатлен на нижней форме PDMS(рисунок 1F), в то время как верхняя форма PDMS состоит только из узорчатых столбов для резервуара белка и входных и выходных портов(рисунок 1F). После того, как NOA 81 поперечно и формы PDMS удаляются из сборки(рисунок 1K), жидкий канал расположен в нижнем слое микрочипа и белковый канал и вход / выход порты расположены на обоих слоях. Рисунок 1L иллюстрирует схему бокового вида чипа диализа, где указаны все слои устройства и их соответствующая толщина. Высота узоров, запечатленных на нижнем слое микросхем (жидкого канала), составляет примерно 45 мкм, в то время как общая высота входных и торговых портов составляет примерно 90 мкм. Белковый резервуар (высота 45 мкм) также проиллюстрирован на рисунке 2D и 2E. Выравнивание двух слоев было исследовано под оптическим микроскопом, и часть мембраны диализа RC, включенная в микрочип, может быть четко различима на рисунке 2D. На той же цифре, воздух был поглощен в жидком канале во время инъекции раствора кристаллизации, как это видно в верхней левой части белка резервуара. Рисунок 2E представляет 17-ю фотографию белкового резервуара после ручного осаждения капли белка с пипеткой и перед инкапсуляцией капли с куском ленты PMMA и Kapton, как описано в шагах 5.2 и 5.3 протокола. Микрофлюидный чип, готовый к использованию для экспериментов по кристаллизации, после инкапсуляции образца белка и склеивания жидких разъемов, изображен на рисунке 2C. Воздухоутвочная сборка гарантирует, что утечки не могут произойти. Текучие разъемы для входных и торговых портов микрофлюидного канала могут быть либо коммерчески доступными, как описано в шаге 4.1 протокола и показаны на рисунке 2C, либоодноразовые лабораторные пипетки советы могут быть использованы для той же цели(рисунок 2B, протокол шаг 4.4). Для изготовления микрофлюидных чипов были выбраны оптически прозрачные и биологически инертные материалы, демонстрирующие высокую совместимость для экспериментов по рентгеновской дифракции на месте при комнатной температуре. Взаимодействия рентгеновских лучей, поглощения и рассеяния, с материалами, состоящими из микрофлюидного устройства и окружающей атмосферы (воздух) генерировать сигнал, известный как фоновый шум. Этот шум суммирует сигнал дифракции кристаллов белка, записанный детектором, разрушая соотношение сигнала к шуму и должен поддерживаться как можно более низким во время рентгеновского сбора данных дифракции. Мы оценили фоновый шум, генерируемый материалами, состоящими из белкового резервуара, который находится на прямом пути рентгеновского луча. Белковый резервуар состоит из мембраны диализа RC, ленты Kapton и двух частей PMMA, один используется в качестве субстрата для микрочипа и один используется для инкапсуляции образца белка. Толщина PMMA составляет 2 х 175 мкм, ленты Kapton 20 мкм, а мембрана диализа RC составляет около 40 мкм толщиной(рисунок 1L). Общая толщина этих слоев составляет около 410 мкм, а слой NOA 81 не находится в прямом рентгеновском пути. Помимо толщины производственных материалов, их плотность также имеет решающее значение для измерения фонового рассеяния шума, так как рентгеновское рассеяние увеличивается вместе с элементарным атомным числом. По этой причине поток гелия (функция, предоставляемая на BM30A-FIP в ESRF) использовался вместо воздуха во время сбора данных для характеристики материала и для экспериментов по дифракции белка. Рисунок 3C иллюстрирует фоновый шум, порожденный лентой Kapton, мембраной диализа RC, листом PMMA и их сборкой в атмосфере гелия. Каждый материал подвергался воздействию рентгеновских лучей длиной 20 с волны 0,98 и детектора образцов на 200 мм. Эксперименты проводились на балочной линии BM30A-FIP в ESRF, как поясняется в шаге 7 протокола. Диффузные кольца, приписываемые взаимодействию рентгеновского луча с материалами, можно отличить по ленте Kapton с разрешением ниже 4 евро, листу PMMA между 4-8 и диализной мембране между разрешением 4-5. Фоновый шум, генерируемый чипом диализа, в основном наблюдается в разрешении ниже 6, что не влияет на обработку данных дифракции с высоким разрешением больших кристаллов лизозима. Интенсивность рассеяния фона в качестве функции разрешения для микрочипа и отдельных материалов показана в другом месте19. В измерении, представленном на рисунке 3C, диализ чип был пуст любого раствора (белок или осадки раствор) и вклад присутствия раствора в фоновом шуме не был измерен. Чипы были установлены перед рентгеновским лучом с 3D-печатной поддержкой(рисунок 3B), предназначенной для экспериментов на месте дифракции19. Тем не менее, та же поддержка с размерами, равными размерам стандартной кристаллизации пластины 96-well/SBS, может использоваться для выполнения экспериментов по кристаллизации от 1 до 3 одновременно, так как она может одновременно в содержать до 3фишек (рисунок 3A). Были проведены эксперименты по оценке эффективности микрофлюидных устройств для кристаллизации модельных растворимых белков методом микродиализа. Плавный канал был заполнен, как описано в шаге 4 протокола, в то время как шаги 5 и 6 описали, как инкапсулировать образец белка в выделенной белковой резервуаре и как настроить эксперименты кристаллизации. Рисунок 4 показывает кристаллы лизозима, выращенные на 293 K под 1,5 М хлорида натрия (NaCl) с 0,1 М ацетата натрия (CH3COONa) рН 4,0 (A) и под 1 M NaCl, 0.1 M CH3COONa pH 4.5 с 30% полиэтиленгликоль (PEG) 400(B). Лиофилизированный порошок лизозима растворялся в воде до конечной концентрации 30 мг мл-1 или в 20 мМХ CH3COONa pH 4.2 буфера до окончательной концентрации 20 мг мл-1 для экспериментов, иллюстрированных на рисунках 4A и 4Bсоответственно. Объем образца белка в обоих экспериментах составил около 0,3 мкл, а MWCO мембраны диализа RC, встроенной в микрочипы, находится в диапазоне 6-8 кДа. Кристаллы лизозима, показанные на рисунке 3A, росли в пределах 1 ч, а кристаллы на рисунке 3B росли в течение 30 минут с начала эксперимента. Эксперименты по кристаллизации проводились в статических условиях. Тем не менее, былопоказано 19, что проведение экспериментов в условиях течения дает возможность динамически обмениваться условиями кристаллизации и изучать фазовые диаграммы, проверяя обратимость метода микродиализа. На месте Рентгеновские данные дифракции кристаллов лизозима, показанные на рисунке 4A, были собраны, чтобы продемонстрировать пригодность чипов диализа для таких экспериментов. Сбор данных осуществлялся на линии луча BM30A-FIP (ESRF) при комнатной температуре, как описано в шаге 7.2.1 протокола. Микрочипы были установлены на линии луча с помощью 3D-печатной поддержки(рисунок 3B)и полные наборы данных рентгеновской дифракции были собраны из двух одиночных кристаллов лизозима, выращенных на чипе в условиях, данных во второй строке таблицы 1. Наблюдаемые отражения наборов данных были обработаны, проиндексированы и интегрированы с использованием XDS48, а молекулярная замена и уточнение были выполнены с использованием Phaser49 и Phenix52,соответственно. Кристаллографическая статистика полного набора данных каждого кристалла лизозима и слияния двух наборов данных представлена в таблице 2. Для молекулярной замены использовалась запись PDB 193L. Карты плотности электронов из одного кристалла лизозима и слитый набор данных двух кристаллов были получены на уровне 1,95 и 1,85 евро, соответственно, и иллюстрируются на рисунках 5A и 5B. Обе карты плотности электронов показывают подробную структурную информацию, которая может быть получена с помощью экспериментов по дифракции на месте, проводимых непосредственно на микрочипе диализа при комнатной температуре из одного кристалла или из нескольких кристаллов, что делает чипы совместимыми для исследований рентгеновской кристаллографии на месте. Рисунок 1: Схематическая иллюстрация изготовления чипа диализа. (A) СУ-8 смолы откладывается на двух кремниевых пластин и спина покрытием. (B)Мастер СУ-8 приобретается после облучения фоторезист с ультрафиолетовым светом через фотомаск и разработки неэкспонированных частей. (C) PDMS распределяется на SU-8 мастеров и после того, как вылечить на 338 K за 1ч,( D ) 2 PDMS формы производства реплики литья и отпечатков микро-шаблоны очищены от мастеров и (E) сократить до соответствующего размера. (F) формы PDMS поддерживаются на стеклянной горке, включающей мембрану диализа RC между двумя центральными столбами. (G) 2 формы PDMS затем выровнены и высушены в течение 30 мин в вакуумной камере. (H) NoA 81 смолы наливают между двумя формами и (Я) заполняет пространство капиллярности. (J) После первого воздействия УФ-излучения, нижняя форма PDMS удаляется и сборка откладывается на листе PMMA. (K) Второе уф-облучение следует для того, чтобы полностью полимеризировать смолу NOA 81 и диализ чип готов к использованию после удаления оставшейся верхней формы PDMS. (L)Схема бокового просмотра чипа диализа, где указаны все слои устройства и их соответствующая толщина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Диализ чипов встраивания RC диализа мембраны для кристаллизации белка на чипе и на месте рентгеновской дифракции экспериментов. (A) NOA 81 микрочипов на 175 мкм толщиной PMMA субстрат с белковым резервуаром 0,1 л (слева) и 0,3 л (справа) номинального объема. (B)Микрочипы с наконечниками пипеток в качестве жидких разъемов, приклеенных к входным и розеткным портам жидкого канала. (C)Изображение микрочипа во время эксперимента по кристаллизации. Образец белка инкапсулирован куском листа PMMA толщиной 175 мкм и лентой Kapton. Разъемы Peek Nanoport используются для входных и торговых портов жидкого канала. (D)Верхний вид белкового резервуара во время циркуляции раствора кристаллизации в жидком канале. Воздух находится в ловушке в верхней части резервуара прямо под мембраной диализа RC, которая может быть четко обнаружена. (E)Верхний вид резервуара диализа через оптический микроскоп во время осаждения образца белка. Белковая капля откладывается прямо над встроенной мембраной диализа RC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: 3D-печатная поддержка (A) для микрочипов, используемых во время экспериментов кристаллизации и (B) установлен перед рентгеновским лучом на BM30A-FIP луча на ESRF для на месте рентгеновской дифракции экспериментов. (C)Фоновый шум, порожденный взаимодействием рентгеновских лучей с Каптоном, мембраной диализа RC, PMMA и чипом диализа (слева направо). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Кристаллизация лизозима с помощью метода микродиализа. (A) Lysozyme (30 мг мл-1) кристаллы, выращенные на чипе под 1,5 М NaCl и 0,1 МЧ CH3COONa pH 4.0 и (B) lysozyme (20 мг мл-1) кристаллы, выращенные в условиях кристаллизации, содержащие 1 M NaCl, 0.1 M CH3COONa pH 4.5, 5. и 30% PEG 400. Оба эксперимента были проведены на 293 K. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Карты плотности электронов усовершенствованной структуры лизодзима из (A) одного кристалла и (B) слитого набора данных из двух кристаллов, выращенных на чипе с помощью микродиализа. Карты были получены на 1,95 и 1,84 евро, соответственно, контурные на 1 “. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. белок Концентрация белка(мг мл-1) Белковый бафффер Первоначальная концентрациястремительное решение MWCO of RCдиализная мембрана(kDa) Нет, нет, нет. температура(К) Я не против. лизоцим No 30 Вода 1.5 M NaCl0.1 M CH3COONa pH 4.0 6 – 8 293 лизоцим No 20 20 мМЧCH 3COONa рН 4,2 1 M NaCl0.1 M CH3COONa pH 4.530% ПЕГ 400 6 – 8 293 Таблица 1: Состав белкового буфера и стремительного раствора для кристаллизации лизозима с помощью метода микродиализа. Кристаллы лизозима, выращенные на чипе с условиями, предусмотренными во второй линии, использовались для сбора данных о рентгеновской дифракции на месте. белок лизоцим лизоцим лизоцим Количество кристаллов 1 1 2 Количество дифракционных кадров 40 30 70 Колебания (к) на экспозицию 1 1 Время экспозиции (ы) 30 30 Температура (K) 293 293 293 Космическая группа P43212 P43212 P43212 Параметры ячейки единицы 78.86 78.86 37.8790.0 90.0 90.0 79.17 79.17 37.9590.0 90.0 90.0 78.47 78.47 37.6590.0 90.0 90.0 Диапазон разрешения (к) 27.31 – 1.95(2.02 – 1.95) 27.39 – 1.96(2.03 – 1.96) 27.17 – 1.85(1.91 – 1.85) Мозаика (к) 0.319 0.121 Всего отражений (наблюдается) 25127 (3552) 19991 (3001) Уникальные отражения (наблюдаемые) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975) Редуданси 2.90 (2.61) 2.41 (2.27) Полнота (%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15) Означает, что я/σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7 CC(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0 R-слияние 0.184 R-meas 0.139 0.221 0.219 Р-пим 0.116 Размышления, используемые в доработке 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965) Размышления, используемые для R-бесплатно 864 (78) 846 (85) 1039 (96) R-работа 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102) R-бесплатно 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703) Количество не водородных атомов 1069 1071 1096 Макромолекул 1012 1012 1012 Вода 55 57 82 лиганд 2 2 2 Остатки белка 131 131 131 Rms (облигации, к) 0.008 0.009 0.005 Rms (углы, к) 1.17 1.26 1.05 Рамачандран выступает (%) 98.43 97.64 99.21 Рамачандран допускается (%) 1.57 2.36 0.79 Выбросы Рамачандрана (%) 0.00 0.00 0.00 Авегаре B-фактор 34.26 28.54 24.34 белок 33.94 28.14 23.62 Вода 40.23 35.57 33.16 Лигандов 33.23 29.63 24.77 Таблица 2: Параметры сбора данных, кристаллографическая и уточненная статистика кристаллов лизодзима, выращенных на чипе с помощью метода микродиализа. Значения, предоставляемые в скобках, соответствуют оболочке с самым высоким разрешением. Четвертый столбец соответствует значениям, полученным после слияния наборов данных второго и третьего столбца.

Discussion

Для кристаллизации белка на чипе с помощью метода микродиализа и экспериментов по рентгеновской дифракции на месте при комнатной температуре разработано микрофлюидное устройство. NoA 81 чипов интеграции RC диализ мембран любого MWCO для того, чтобы использовать микродиализ для кристаллизации белка на чипе могут быть изготовлены. Были использованы материалы для изготовления с относительно высокой рентгеновской прозрачностью, что сделало чипы совместимыми для кристаллографии белка in situ. Материалы изготовления, которые составляют отсек для кристаллизации белка устройства (PMMA, Kapton, RC диализ мембраны) были оценены для создания низкого фонового шума. В частности, фоновый шум, генерируемый чипом диализа, в основном наблюдается при низком разрешении (> 6 евро) и не влияет на обработку данных дифракции высокого разрешения больших кристаллов лизозима, необходимых для определения структуры белка. Автоматизация сбора данных усиливается с помощью 3D печатной поддержки, которая может быть установлена непосредственно в макромолекулярных кристаллических лучах и нести до трех микрочипов одновременно. Таким образом, избегается ручная уборка и манипуляция хрупкими кристаллами белка. Кроме того, сбор данных происходит при комнатной температуре, избегая необходимости криопротекторизации, которая может быть связана с конформативными изменениями отродной белковой структуры 2,3.

Использование микродиализа в качестве метода выращивания кристаллов на чипе позволяет точно контролировать и контролировать процесс кристаллизации. Как обсуждалось во введении, большинство обычных методов кристаллизации белка были реализованы с использованием микрофлюидныхустройств 11,14. Однако преимущества диализа для кристаллизации белка еще не были полностью использованы в микромасштабе. Микродиализ on-chip предоставляет возможность изучения фазовых диаграмм и проведения скрининга и оптимизации условий кристаллизации с тем же образцом белка19. Для прототипов, представленных в этой работе, потребление белка на чип ограничено до 0,1 или 0,3 мл. Основываясь на экспериментальной работе до сих пор, наиболее важные шаги протокола вытекают не из процедуры изготовления чипов, а из процесса кристаллизации. Протокол изготовления включает в себя много шагов, но он прост и позволяет изготовить многочисленные устройства (от 20 до 30 фишек) в течение одного дня в чистой комнате, с относительно недорогими материалами. Тем не менее, кристаллизация белков на чипе может быть деликатной процедурой из-за внутренней стохастичной природы нуклеации и роста кристаллов, особенно в микромасштабе. Было описано пример, в котором были использованы устоявшиеся условия для кристаллизации лизозима, который дал надежные, четко определенные кристаллы, пригодные для сбора данных о дифракции на месте. Тем не менее, трудности могут возникнуть из-за использования более сложных целей белка, таких как мембранные белки, где среда кристаллизации гораздо сложнее, фазовые диаграммы не известны и хорошо работающие условия кристаллизации еще не хорошо установлены. Чип диализа дает возможность превзойти эти трудности и изучить фазовые диаграммы на чипе, не утилизируя ценный и часто дорогостоящий образец белка, просто обмениваясь раствором кристаллизации в микрофлюидальном канале.

Универсальность микрофлюидных устройств проистекает из использования микродиализа для кристаллизации белка на чипе, чтобы обратимо контролировать условия кристаллизации и картировать концентрацию и температуру различных фазовых диаграмм с использованием низкого объема белка. Кроме того, устройство совместимо с экспериментами по рентгеновской дифракции на месте, а прототипирование устройств является недорогим и быстрым. Многочисленные, изоморфные кристаллы растворимых и мембранных белков (в процессе подготовки) могут быть выращены на чипе, и ожидается, что все эти функции могут быть использованы для серийных рентгеновских кристаллических исследований сложных целей белка на синхротронных и XFEL объектов. Наконец, выполнение исследований, проведенных на чипе и на месте, является будущей возможностью, которая может быть представляет значительный интерес для кристаллографического сообщества. Поэтому, выращивая кристаллы на диализном чипе и вводя реагенты в микрофлюидный канал, либо вручную (с помощью шприца), либо автоматически (с системой жидкости контроля давления или шприц-насосом), будущие усилия будут сосредоточены на доказательстве того, что микрофлюидные чипы могут быть успешно использованы для запуска экспериментов по синхронизации синхротронных лучей.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MBS признает поддержку MI / CNRS по контракту Инструменты в пределах 2014-2015. NJ признает CEA Международная докторская исследовательская программа (Irtelis) для phD стипендий. MBS и SJ признают финансирование программы исследований и инноваций «Горизонт 2020» Европейского союза в рамках грантового соглашения Мари Склодовской и Кюри No 722687. MBS, SJ и NJ благодарят LIPhy (UGA) за создание чистой комнаты для экспериментов по микрофабрикации. IBS признает интеграцию в Междисциплинарный научно-исследовательский институт Гренобля (IRIG, CEA).

Materials

3 in wafer Silicon Materials Inc. Silicon wafer
Centrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
CleWin 3.0 WieWeb software Designing software
Epoxy glue Devcon 5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors Cluzeau Info Lab N-333 NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme Roche 10 837 059 001 Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554 Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS Sigma-Aldrich 440191 Silane, chemical
Hot plate Sawatec HP-200-Z-HMDS BM Hot plate
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Solvent
Kapton tape DuPont Polyimide tape
Mask aligner SUSS MicroTec MJB4 Mask aligner, UV source
Membrane filter Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide Fisher Scientific 12164682 3 x 1 in glass slides
NOA81 Norland Products Inc.  NOA81 Photocurable resin
Oven Memmert Oven
Parafilm Sigma-Aldrich P6543 Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
PEG 400 Hampton Research HR2-603 Chemical
Petri dish Sigma-Aldrich P5731 100 x 15 mm
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Plasma equipment Diener Electronic ZEPTO Plasma treatment
PMMA Goodfellow 137-745-63 PMMA sheets 150×150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system Elveflow OB1 MK3+ Pressure/vacuum controller
PTFE tubing Elveflow/Darwin microfluidics LVF-KTU-15 PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane Spectra/Por Various MWCOs
Scalpel Swann-Morton Carbon steel surgical blades
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Solidworks Dassault Systemes 3D-CAD designing software
Spin coater SPS Spin150 Wafer spinner
SU-8 3000 series MicroChem Corp. SU-8 3050 Photoresist
Syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker Uvitec CL-508 UV crosslinker
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garman, E. F. Radiation damage in macromolecular crystallography: what is it and why should we care. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 339-351 (2010).
  2. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  3. Fraser, J. S., et al. Accessing protein conformational ensembles using room-temperature X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16247-16252 (2011).
  4. Gotthard, G., et al. Specific radiation damage is a lesser concern at room temperature. IUCrJ. 6 (4), 665-680 (2019).
  5. Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 32-47 (2016).
  6. Gicquel, Y., et al. Microfluidic chips for in situ crystal X-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).
  7. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470, 73-78 (2011).
  8. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Science Reports. 4, 6026 (2014).
  9. Pawate, A. S., et al. Towards time-resolved serial crystallography in a microfluidic device. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology Communications. 71, 823-830 (2015).
  10. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 73, 373-378 (2017).
  11. Leng, J., Salmon, J. -. B. Microfluidic crystallization. Lab on a Chip. 9, 24-34 (2009).
  12. Morel, M., Galas, J. -. C., Dahan, M., Studer, V. Concentration landscape generators for shear free dynamic chemical stimulation. Lab on a Chip. 12, 1340-1346 (2012).
  13. Miralles, V., Huerre, A., Malloggi, F., Jullien, M. -. C. A review of heating and temperature control in microfluidic systems: techniques and applications. Diagnostics. 3, 33-67 (2013).
  14. Sui, S., Perry, S. L. Microfluidics: from crystallization to serial time-resolved crystallography. Structural Dynamics. 4, 032202 (2017).
  15. Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14431-14436 (2004).
  16. Laval, P., Lisai, N., Salmon, J. -. B., Joanicot, M. A microfluidic device based on droplet storage for screening solubility diagrams. Lab on a Chip. 7, 829-834 (2007).
  17. Shim, J. -. U., et al. Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics. Journal of the American Chemical Society. 129, 8825-8835 (2007).
  18. Selimovic, S., Gobeaux, F., Fraden, S. Mapping and manipulating temperature-concentration phase diagrams using microfluidics. Lab on a Chip. 10, 1696-1699 (2010).
  19. Junius, N., et al. A microfluidic device for both on-chip dialysis protein crystallization and in situ X-ray diffraction. Lab on a Chip. 20, 296-310 (2020).
  20. Greaves, E. D., Manz, A. Towards on-chip X-ray analysis. Lab on a Chip. 5, 382-391 (2005).
  21. Dhouib, K., et al. Microfluidic chips for the crystallization of biomacromolecules by counter-diffusion and on-chip crystal X-ray analysis. Lab on a Chip. 9, 1412-1421 (2009).
  22. Guha, S., Perry, S. L., Pawate, A. S., Kenis, P. J. A. Fabrication of X-ray compatible microfluidic platforms for protein crystallization. Sensors and Actuators B. Chemical. 174, 1-9 (2012).
  23. Sui, S., et al. Graphene-based microfluidics for serial crystallography. Lab on a Chip. 16, 3082-3096 (2016).
  24. Russo Krauss, I., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Science. 14, 11643-11691 (2013).
  25. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 70, 2-20 (2014).
  26. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A droplet-based, composite PDMS/Glass capillary microfluidic system for evaluating protein crystallization conditions by microbatch and vapor-diffusion methods with on-chip X-ray diffraction. Angewandte Chemie. 43, 2508-2511 (2004).
  27. Talreja, S., Kim, D. Y., Mirarefi, A. Y., Zukoski, C. F., Kenis, P. J. A. Screening and optimization of protein crystallization conditions through gradual evaporation using anovel crystallization platform. Journal of Applied Crystallography. 38, 988-995 (2005).
  28. Hansen, C. L., Classen, S., Berger, J. M., Quake, S. R. A microfluidic device for kinetic optimization of protein crystallization and in situ structure determination. Journal of American Chemical Society. 128, 3142-3143 (2006).
  29. Schieferstein, J. M., et al. X-ray Transparent microfluidic platforms for membrane protein crystallization with microseeds. Lab on a Chip. 18, 944-954 (2018).
  30. Ghazal, A., et al. Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences. Lab on a Chip. 16, 4263-4295 (2016).
  31. Li, L., Ismagilov, R. F. Protein crystallization using microfluidic technologies based on valves, droplets, and SlipChip. Annual Review of Biophysics. 39, 139-158 (2010).
  32. Du, W., Li, L., Nichols, K. P., Ismagilov, R. F. SlipChip. Lab on a Chip. 9, 2286-2292 (2009).
  33. Zhang, S., et al. Microfluidic platform for optimization of crystallization conditions. Journal of Crystal Growth. 472, 18-28 (2017).
  34. Abdallah, B. G., et al. Protein crystallization in an actuated microfluidic nanowell device. Crystal Growth & Design. 16, 2074-2082 (2016).
  35. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26, 406-412 (2019).
  36. de Wijn, R., et al. A simple and versatile microfluidic device for efficient biomacromolecule crystallization and structural analysis by serial crystallography. IUCrJ. 6, 454-464 (2019).
  37. Shim, J. -. U., Cristobal, G., Link, D. R., Thorsen, T., Fraden, S. Using microfluidics to decouple nucleation and growth of protein crystals. Crystal Growth & Design. 7, 2192-2194 (2007).
  38. de Jong, J., Lammertink, R. G. H., Wessling, M. Membranes and microfluidics: a review. Lab on a Chip. 6, 1125-1139 (2006).
  39. Paustian, J. S., Nery Azevedo, R., Lundin, S. T. B., Gilkey, M. J., Squires, T. M. Microfluidic microdialysis: spatiotemporal control over solution microenvironments using integrated hydrogel membrane microwindows. Physical Review X. 3, 041010 (2013).
  40. Kornreich, M., Heymann, M., Fraden, S., Beck, R. Cross polarization compatible dialysis chip. Lab on a Chip. 14, 3700-3704 (2014).
  41. Song, S., Singh, A. K., Shepodd, T. J., Kirby, B. J. Microchip dialysis of proteins using in situ photopatterned nanoporous polymer membranes. Analytical Chemistry. 76, 2367-2373 (2004).
  42. Skou, M., Skou, S., Jensen, T. G., Vestergaard, B., Gillilan, R. E. In situ microfluidic dialysis for biological small-angle X-ray scattering. Journal of Applied Crystallography. 47, 1355-1366 (2014).
  43. Zou, L., et al. A multistage dialysis microdevice for extraction of cryoprotectants. Biomedical Microdevices. 19, 30 (2017).
  44. Satya Eswari, J., Naik, S. A critical analysis on various technologies and functionalized materials for manufacturing dialysis membranes. Materials Science for Energy Technologies. 3, 116-126 (2020).
  45. Spano, M., Salmon, J. -. B., Junius, N. FR3044685A1. UJF. , (2015).
  46. Bartolo, D., Degre, G., Nghe, P., Studer, V. Microfluidic stickers. Lab on a Chip. 8, 274-279 (2008).
  47. Junius, N., et al. A crystallization apparatus for temperature controlled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
  48. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 125-132 (2010).
  49. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and developments of COOT. Acta Crystallographica, Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  51. Apostolopoulou, V., Junius, N., Sear, R. P., Budayova-Spano, M. Mixing salts and polyethylene glycol into protein solutions: The effects of diffusion across semipermeable membranes and of convection. Crystal Growth & Design. 20, 3927-3936 (2020).
  52. Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
  53. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28, 153-184 (1998).
  54. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
  55. Baxter, E. L., et al. High-density grids for efficient data collection from multiple crystals. Acta Crystallographica, Section D: Structural Biology. 72, 2-11 (2016).
  56. Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An all-in-one sample holder for macromolecular X-ray crystallography with minimal background scattering. Journal of Visualized Experiments. (149), e59722 (2019).

Tags

Protein CrystallizationMicrofluidic ChipsDialysisIn Situ X-ray DiffractionPDMSSU8 MasterRegenerated Cellulose Dialysis MembraneProtein Sample VolumeCrystallization ConditionsNucleationCrystal GrowthPhase Diagrams

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image