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Chemistry

Cristallizzazione delle proteine su chip mediante microdialisi per studi di diffrazione a raggi X in situ

Published: April 11, 2021
doi:
10.3791/61660
, , , , ,
1Université Grenoble Alpes, CEA, CNRS, IBS, 2CNRS, Solvay LOF, UMR 5258,Université Bordeaux, 3ELVESYS SAS

Summary

Questo documento descrive in dettaglio il protocollo di fabbricazione dei chip microfluidici sviluppati per la cristallizzazione delle proteine su chip con il metodo della dialisi e gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ. Il processo di microfabbricazione consente di integrare una membrana semipermeabile di dialisi della cellulosa rigenerata con qualsiasi taglio di peso molecolare, tra due strati del chip.

Abstract

Questo protocollo descrive la produzione di dispositivi microfluidici riproducibili ed economici che coprono l’intera tubazione per cristallizzare le proteine su chip con il metodo della dialisi e consentono esperimenti di cristallografia singola o seriale in situ a temperatura ambiente. Il protocollo descrive in dettaglio il processo di fabbricazione dei microchip, la manipolazione degli esperimenti di cristallizzazione su chip e il trattamento dei dati di diffrazione a raggi X raccolti in situ per la spiegazione strutturale del campione proteico. La caratteristica principale di questa procedura di microfabbricazione risiede nell’integrazione di una membrana di dialisi della cellulosa rigenerata disponibile in commercio e semipermeabile tra due strati del chip. Il taglio del peso molecolare della membrana incorporata varia a seconda del peso molecolare della macromolecola e dei precipitanti. Il dispositivo sfrutta i vantaggi della tecnologia microfluidale, come l’uso di volumi minuti di campioni (<1 μL) e la messa a punto sui fenomeni di trasporto. Il chip li accoppiava con il metodo della dialisi, fornendo un controllo preciso e reversibile sul processo di cristallizzazione e può essere utilizzato per studiare diagrammi di fase delle proteine su scala microliter. Il dispositivo è modellato utilizzando una resina fotocurabile a base di tiolene con litografia a impronta morbida su un substrato polimerico otticamente trasparente. Inoltre, è stata valutata la dispersione di fondo dei materiali che componevano i microchip e generavano rumore di fondo rendendo il chip compatibile per esperimenti di diffrazione a raggi X in situ. Una volta che i cristalli proteici vengono coltivati su chip fino a dimensioni adeguate e uniformità della popolazione, i microchip possono essere montati direttamente davanti al fascio di raggi X con l’aiuto di un supporto stampato in 3D. Questo approccio affronta le sfide derivanti dall’uso di crioprotettivi e dalla raccolta manuale negli esperimenti convenzionali di cristallografia proteica attraverso un modo semplice ed economico. I set completi di dati di diffrazione a raggi X da più cristalli di lysozima isomorfo coltivati su chip sono stati raccolti a temperatura ambiente per la determinazione della struttura.

Introduction

Chiarire la struttura tridimensionale (3D) delle macromolecole biologiche è una ricerca incessante nella biologia strutturale dove la cristallografia a raggi X rimane la principale tecnica di indagine. Applicato per svelare i dettagli strutturali delle macromolecole complesse, come le proteine, mira a facilitare la comprensione dei loro meccanismi di azione e il loro coinvolgimento in varie funzioni biologiche. Potenti sorgenti di raggi X ai sincrotroni e ai laser a raggi X a elettroni liberi (XFEL) forniscono tutti gli strumenti necessari per una visione più approfondita della struttura delle proteine a una risoluzione quasi atomica. Nonostante i vantaggi che si offrono con l’uso dei raggi X per gli studi strutturali, ci sono limitazioni intrinseche alla radiazione a raggi X e al processo di cristallizzazione stesso. I danni da radiazioni provocati dall’elevato flusso di raggi X e dai lunghi tempi di esposizione del cristallo proteico davanti al fascio di raggi X sono parametri restrittivi che i cristallografi devono superare utilizzando il raffreddamento criogenico1. Tuttavia, trovare le condizioni ottimali di crioraffreddamento può essere laborioso poiché i cambiamenti conformazionali dalla struttura proteica nativa o dagli artefatti possono esserenascosti 2,3. Inoltre, studi recenti indicano che l’esecuzione di esperimenti di diffrazione a temperatura ambiente porta a minori danni specifici da radiazioni4. Un altro collo di bottiglia nella biologia strutturale è l’acquisizione di cristalli ben diffratti con una dimensionesufficiente 5. I piccoli cristalli sono più facili da produrre, specialmente nel caso delle proteine di membrana, ma sono più suscettibili ai danni da radiazioni anche in condizioni di crioraffreddamento perché un’elevata dose di radiazioni deve essere diretta in un volume inferiore rispetto al caso di cristalli proteici più grandi6. Il nuovo approccio della cristallografia seriale7,8 ai sincrotroni e agli XFEL può aggirare i contenuti dei danni da radiazioni e allo stesso tempo sfruttare cristalli più piccoli (da 200 nm a 2 μm)7 fondendo set di dati da più, cristalli proteici isomorfi e orientati casualmente e approfittando dei progressi tecnologici associati come impulsi di femtosecondo, tempi di esposizione più brevi e fasci di raggi X micro-focalizzati5,7,9,10.

La tecnologia microfluidica è preziosa per la cristallografia a raggi X, che presenta molteplici vantaggi per la cristallizzazione delle macromolecole biologiche e la loro indagine strutturale. Condurre esperimenti di cristallizzazione in dispositivi microfluidici richiede piccoli volumi di campione proteico, vincolando quindi il costo di produzione di queste bio macromolecole di alto valore e facilitando lo screening ad alta produttività e l’ottimizzazione di numerose condizioni di cristallizzazione. Inoltre, l’intrinseco elevato rapporto superficie-volume su scala microfluidica e fenomeni di trasporto limitati alla diffusione consentono un controllo fine dei flussi e dei gradienti di temperatura o concentrazione11,12,13,14,rendendo dispositivi microfluidici adatti alla coltivazione di cristalli di dimensioni uniformi ed esplorando diagrammi di fase15,16,17,18,19. Inoltre, gli strumenti microfluidici mostrano un potenziale distintivo per affrontare un altro ostacolo nella cristallografia proteica, che è la consegna del campione, e la necessità di gestire e raccogliere cristalli proteici prima del loro uso per esperimenti di diffrazione a raggi X. Il metodo della cristallografia a raggi X su chip e in situ elimina la manipolazione dei cristalli e il potenziale deterioramento della qualità cristallina prima della raccolta dei dati. Una vasta gamma di chip microfluidici compatibili per la cristallografia proteica a raggi X in situ sono stati progettati, sviluppati e testati da molti gruppi di ricerca che affrontano le relative restrizioni derivanti dalla natura dei materiali di microfabbricazione e dalle loro interazioni con i raggi X14,19,20,21,22,23. I materiali di fabbricazione devono essere otticamente trasparenti, biologicamente inerti e dimostrare un’elevata trasparenza rispetto alle radiazioni a raggi X e un rapporto segnale-rumore ottimale durante la raccolta dei dati.

La maggior parte dei metodi di cristallizzazione applicati nella cristallografia proteicaconvenzionale 24,25 sono stati implementati anche sulla scala microfluidica11,14 per la cristallizzazione su chip e l’analisi di diffrazione dei raggi X in situ. Apparecchiature microfluidiche semplici, ibride o multistrato che incorporano diffusione del vapore26,evaporazione 27,diffusione dell’interfaccia libera (FID)28,microbatch26o persino semina29 sono state utilizzate per cristallizzare proteine solubili e di membrana. Lo screening ad alta produttività e l’ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazionepossono essere raggiunti 30,31 indispositivi 32,33basati su goccioline o azionati davalvole. In situ Esperimenti di diffrazione a raggi X di obiettivi proteici impegnativi a temperatura ambiente sono stati condotti in microchip fabbricati con vari materiali come PDMS (polidimetilossano), COC (copolimero olefine ciclico), PMMA (poli(metacrilato metile))21,22,26,28,29, pellicole di grafene23, Kapton35, colla epossidica6o NOA (Adesivo ottico Norland)19 e sono stati valutati la trasparenza dei materiali alle radiazioni a raggi X e il loro contributo al rumore di fondo. Inoltre, i microchip sono stati progettati per accoppiare le strategie di raccolta dei dati in situ e seriali in un unico strumento per esperimenti di cristallografia delle proteine a raggi X a sorgenti di sincrotrone23,35,36 e XFELs7.

La raccolta dei dati in situ a temperatura ambiente è stata implementata anche in vari metodi e dispositivi di consegna. Ad esempio, Nogly et al. La struttura cristallina di bR è stata risolta con la risoluzione 2.3 Å, dimostrando la compatibilità di un iniettore LCP con la cristallografia seriale femtosecondi risolta nel tempo (TR-SFX). 55 ha progettato una griglia multicristacrista con alta densità, fabbricata da una plastica policarbonato spessa 100 o 200 μm con fori tagliati al laser di varie dimensioni. Un ulteriore film di policarbonato spesso 5 μm può essere fissato su un lato della griglia quando si utilizza il dispositivo per esperimenti di cristallizzazione a goccia seduta o appesa. Questa griglia ad alta densità può essere utilizzata in diversi modi in quanto i cristalli possono essere caricati direttamente sulle porte del dispositivo o i cristalli possono essere coltivati sul dispositivo tramite diffusione del vapore o il metodo LCP. Inoltre, la griglia può essere regolata in una base magnetica standard e utilizzata per la raccolta di dati a raggi X in situ in condizioni criogeniche o a temperatura ambiente. Più recentemente, Feiler etal. Nello specifico, il supporto comprende un supporto in plastica, un foglio COC trasparente e un foglio di poliimmide strutturato microporosa. È stato progettato per sostituire i vetrini di copertura comunemente usati per impostare gocce di cristallizzazione, consentendo al contempo la manipolazione sul posto come l’ammollo del ligando, la formazione complessa e la protezione criogenica senza aprire la goccia di cristallizzazione o maneggiare manualmente i cristalli. Inoltre, il portacampioni può essere rimosso dalla piastra di cristallizzazione e posizionato su una base magnetica per la raccolta dei dati in situ su linee di fascio standard basate su goniometro. Per la raccolta dei dati sulla temperatura ambiente, il foglio COC viene rimosso prima dell’esperimento e solo la lamina di poliimmide spessa 21 μm contribuisce allo scattering di fondo, che in questo caso è minimo. Questi esempi compongono solo una piccola frazione della ricerca in corso e la moltitudine di microchip versatili sviluppati per la cristallografia proteica a raggi X.

Tuttavia, il metodo di cristallizzazione delle proteine della dialisi non è stato ampiamente incorporato nella microfluidica. La dialisi è un metodo basato sulla diffusione che mira all’equilibrazione della concentrazione del precipitante attraverso una membrana semi-permeabile al fine di avvicinarsi alla concentrazione nominale per la cristallizzazione proteica e consente un controllo preciso e reversibile sulle condizioni di cristallizzazione24. Il taglio del peso molecolare (MWCO) della membrana di dialisi semi-permeabile può essere scelto a seconda del peso molecolare della macromolecola e dei precipitanti per consentire la diffusione di piccole molecole precipitanti pur mantenendo la macromolecola di interesse. A causa della reversibilità del processo di dialisi, può essere utilizzato in combinazione con il controllo della temperatura per disaccoppiare e ottimizzare la nucleazione e la crescita del cristalloin modo indipendente 37 per lo studio dei diagrammi di fase alterando la concentrazione del precipitante mentre si utilizza lo stesso campione proteico. L’integrazione delle membrane in microfluidica è riesaminata da de Jong et al. La pervaporazioneattraverso il PDMS è stata utilizzata da Shim et al. L’acqua permeava attraverso la membrana PDMS spessa 15 μm nel serbatoio proteico del dispositivo microfluidico, alterando successivamente la concentrazione proteica e precipitante.

Viene presentato il protocollo sviluppato da Junius etal. Il protocollo per la fabbricazione del dispositivo si ispira direttamente al lavoro pionieristico svolto da Studer e colleghi12,46 per adesivi micro-fantasia di resina foto-polimerizzabile a base di tiolene NOA 81 incorporando membrane disponibili in commercio, utilizzando litografia a impronta morbida. Una modifica innovativa del metodo ha portato a microchip che hanno permesso l’uso della microdialisi per monitorare e controllare con precisione i parametri sperimentali per la crescita su chip dei cristalli proteici e allo stesso tempo sfruttare i vantaggi della microfluidica, come il ridotto consumo di campioni proteici per esperimento (20 μL) per lo screening e l’ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione mappando diagrammi di fase di concentrazione temperatura-precipitante47. In questo lavoro, viene descritto un protocollo per la produzione di microchip di dialisi che incorporano membrane di dialisi a cellulosa rigenerata (RC) di diversi MWCO al fine di eseguire test di cristallizzazione su chip e raccolta di dati di diffrazione a raggi X in situ. I materiali che comprendono i microchip sono stati valutati per la loro trasparenza ai raggi X19 e i dispositivi possono essere impostati direttamente davanti al fascio di raggi X per esperimenti di diffrazione in situ a temperatura ambiente, escludendo la movimentazione manuale e riducendo al minimo la degradazione dei cristalli proteici fragili. In un caso di studio, i cristalli di lisozima bianco-uovo di gallina sono stati coltivati su chip attraverso la microdialisi generando una popolazione di dimensioni uniformi. Il microchip è stato quindi montato davanti al fascio di raggi X con un supporto stampato in 3D19 e i set di dati di diffrazione in situ completi sono stati raccolti a temperatura ambiente da cristalli multipli e isomorfi, dimostrando l’alto potenziale e la rilevanza dei chip per gli studi di cristallografia seriale del sincrotrone di obiettivi macromolecolari impegnativi.

Protocol

1. Design della maschera e fabbricazione principale Disegnare le geometrie desiderate del dispositivo microfluidico utilizzando qualsiasi software di disegno vettoriale. Per ogni strato del fotoresist che verrà utilizzato per il prossimo passo della fotolitografia, preparare una maschera individuale: una maschera delineata con canali e pilastri e una maschera contenente solo i pilastri. Traduci i file CIF generati dal software di disegno in maschere fotografiche per pellicole. Questo può essere fatto attraverso servizi commerciali. Richiedere la maschera fotografica appropriata a seconda della scelta del fotoresist utilizzato durante la fotolitografia.NOTA: per il fotoresist SU-8, ordina maschere con caratteristiche nere su uno sfondo trasparente. SU-8 è un fotoresist negativo a base epossidica, il che significa che durante l’esposizione alla luce UV (365 nm) le parti esposte ai raggi UV sono retille mentre il resto rimane solubile. Pertanto, tutti i motivi neri sulla maschera non saranno collegati dalla luce UV durante la fotolitografia. Canali e pilastri saranno incisi sui maestri. Prepara due master su wafer di silicio per il design di ogni chip fotolitografia usando fotoresist negativo SU-8.NOTA: I passaggi 1.3.1-1.3.7 vengono eseguiti in una camera pulita. I passaggi descritti di seguito sono i passaggi tradizionali della fotolitografia seguiti dalla litografia morbida PDMS, che sono descritti in molti libri di testo. Tutti i valori dei parametri sperimentali (fotoresist, durata del tempo, temperatura, ecc.) dipendono da molti parametri sottili e devono essere ottimizzati a seconda dei diversi apparecchi utilizzati. Utilizzare un wafer di silicio da 3 pollici e trattare la superficie con plasma per 90 s, al fine di facilitare la deposizione e l’attacco del fotoresist SU-8. Versare circa 3 mL di resistenza SU-8 al centro del wafer e girare il SU-8 fino allo spessore desiderato(Figura 1A). Per uno spessore nominale di 50 μm, utilizzare SU-8 3050 e spin coat per 10 s a 500 giri/min e successivamente per 30 s a 3500 giri/min. Cuocere morbido il fotoresist su una piastra calda per 15 min a 368 K per essere parzialmente solidificato consentendo al solvente contenuto nella resina di evaporare e impedirgli di attaccarsi sulla fotomaschera. Successivamente, lasciare il wafer a temperatura ambiente per 2 minuti. Esporre il fotoresist alla luce UV (Figura 1B). Utilizzare un allineatore di maschere con una potenza di esposizione di 35 mW cm-2 e 8 s. Procedere con la cottura post-esposizione. Posizionare il wafer su una piastra calda per 5 min a 368 K per completare la fotoreazione invocata dall’esposizione ai raggi UV. Rimuovere tutta la resistenza SU-8 che non è stata reticolata posizionando il wafer in un bagno contenente acetato di etere metile glicole propilenico (PGMEA) e mescolare per 15 minuti. Risciacquare il wafer con isopropanolo fino a quando non è possibile osservare precipitazioni sfocate. Asciugare il wafer con gas azoto e conservarlo in una piastra di Petri (dimensioni standard 100 mm x 15 mm). Trattare la superficie del wafer con un silano al fine di facilitare il distacco di polidimetilsiloxano (PDMS) che verrà utilizzato per fabbricare 2 francobolli. Depositare il wafer su una piastra calda maschiata a 368 K per 10 minuti sotto l’atmosfera di vapore dell’esametildisilazane (HMDS).NOTA: Se staccare il PDMS dal wafer diventa difficile dopo diversi usi, la superficie del wafer deve essere trattata di nuovo con vapore HMDS. Il primo master contenente i canali e i pilastri è pronto. Ripetere questi passaggi e preparare il secondo master modellando solo i pilastri.NOTA: Durante la fotolitografia, l’obiettivo è quello di ottenere le geometrie del dispositivo sui master SU-8 con un’altezza di 50 μm. Tuttavia, una volta fabbricati i due master SU-8, misurare l’altezza delle geometrie incise sui maestri con un profilometro al fine di acquisire il valore sperimentale. Il valore misurato per entrambi i master SU-8 fabbricati per questo protocollo è di circa 45 μm. 2. Fabbricazione stampi PDMS NOTA: I seguenti passaggi del protocollo possono essere eseguiti in qualsiasi laboratorio purché venga utilizzata una cappa di flusso laminare, la luce gialla nella stanza viene utilizzata quando si lavora con la resina NOA 81 (passaggi 3.6-3.11) ed è disponibile una fonte di luce UV per polimerizzare la resina NOA 81 (passaggi 3.7 e 3.11). Preparare 50 g di base in silicone PDMS e il suo agente polimerizzante in un rapporto di massa 10:1. Mescolare entrambi gli ingredienti in un becher con una spatola e posizionare la miscela in una camera a vuoto per rimuovere tutte le bolle d’aria. Versare 25 g del PDMS premiscolato nel master SU-8 (conservato in una piastra di Petri) modellando i canali e i pilastri fino ad un’altezza di circa 5 mm. Versare i restanti 25 g del PDMS nel secondo master patterning SU-8 solo i pilastri fino ad un’altezza di circa 5 mm(Figura 1C). Mettere entrambe le piastre di Petri in forno e curare gli strati PDMS a 338 K per 1 h. Tagliare lo strato PDMS stagionato attorno ai motivi dei maestri SU-8 con un bisturi e staccare delicatamente gli stampi PDMS dai maestri(Figura 1D).NOTA: La procedura sopra descritta, chiamata stampaggio della replica, viene spesso utilizzata per preparare stampi di PDMS che verranno attaccati alle superfici di vetro e faranno parte di un dispositivo microfluidico53. In questo protocollo, gli stampi PDMS non fanno parte del chip, ma vengono utilizzati come intermedi per la fabbricazione del chip. Per ogni progetto, 2 stampi PDMS sono preparati dai rispettivi master SU-8(figure 1D e 1E)e saranno utilizzati di conseguenza (come descritto di seguito) per la fabbricazione del microchip. 3. Fabbricazione di chip di dialisi Posizionare lo stampo PDMS modellando sia i canali che i pilastri su uno scivolo rigido in vetro al microscopio (dimensioni standard 3 x 1 in. ) con i motivi rivolti verso l’alto(Figura 1F). Il pilastro centrale che corrisponde al serbatoio proteico supera verticalmente di 45 μm dalla superficie orizzontale dello stampo PDMS. Tagliare e separare un pezzo secco della membrana di dialisi della cellulosa rigenerata (RC) e depositarlo sul pilastro centrale dello stampo PDMS, che è supportato sul vetrino(Figura 1F).NOTA: La membrana di dialisi RC è disponibile in commercio e il taglio del peso molecolare (MWCO) viene scelto di conseguenza con il peso molecolare della proteina in esame e i precipitanti utilizzati. La dimensione del pezzo della membrana di dialisi RC dipende dal design del chip. In questo protocollo, 2 prototipi sono progettati dove il volume del serbatoio proteico è di 0,1 o 0,3 μL. In questi casi, la dimensione del pezzo di membrana di dialisi è rispettivamente 2 x 2 mm2 o 4 x 4 mm2. Posizionare il secondo stampo PDMS modellando solo i pilastri rivolti verso il basso sopra lo stampo PDMS supportato sullo scivolo di vetro (Figura 1F). Il pilastro centrale di questo stampo corrisponde al serbatoio proteico e supera verticalmente (rivolto verso il basso) di 45 μm dalla superficie orizzontale. Allineare i pilastri centrali dei 2 stampi PDMS. La membrana di dialisi RC è “sandwich” tra i 2 stampi PDMS (Figura 1G).NOTA: L’allineamento tra le microstrutture dei 2 stampi PDMS può essere realizzato visivamente, senza alcuna apparecchiatura aggiuntiva. Altrimenti, questa manipolazione può essere ottenuta al microscopio. Un piccolo spostamento tra i serbatoi non è problematico, purché il canale fluido e i punti di ingresso o di uscita non siano interamente coperti. Essiccare l’assemblaggio per 30 minuti in una camera a vuoto per rimuovere tutte le bolle d’aria intrappolate negli stampi PDMS e per favorire l’inserimento della resina durante la fase successiva della fabbricazione.NOTA: I 2 stampi PDMS sono mantenuti in posizione dall’adesione PDMS-PDMS e non è richiesta alcuna pressione aggiuntiva o altro modo di incollaggio temporaneo. Riempire lo spazio vuoto tra i 2 stampi PDMS con la resina fotocurabile a base di tiolene NOA 81 per imbibizione capillare(Figura 1H e 1I). Curare la resina per esposizione alla luce UV (365 nm) per 8 s utilizzando una lampada UV collimata (potenza 35 mW cm-2).NOTA: Questa prima esposizione consente di collegare parzialmente la resina NOA 81 poiché un sottile strato di NOA 81 a contatto con gli stampi PDMS su entrambi i lati rimane non curato. Tagliare l’eccesso di NOA 81 dai lati esterni degli stampi PDMS con un bisturi. Rimuovere lo stampo PDMS superiore con il NOA 81 parzialmente retinato bloccato su di esso dallo stampo PDMS inferiore e dallo scivolo di vetro. Tagliare un foglio PMMA spesso 175 μm nelle dimensioni standard di uno scivolo di vetro al microscopio (3 x 1 pollici) e staccare i fogli di protezione in plastica da ciascun lato del pezzo PMMA. Premere delicatamente l’assieme dello stampo PDMS superiore e il NOA 81 parzialmente polimerizzato sul pezzo PMMA (Figura 1J). Curare nuovamente NOA 81 per esposizione alla luce UV per 60 s e rimuovere lo stampo PDMS superiore (Figura 1K). La resina aderisce al substrato PMMA senza ulteriori trattamenti.NOTA: Gli stampi PDMS possono essere riutilizzati circa fino a 5 volte dopo averli laviati con isopropanolo e acetone, purché gli stampi non siano piegati. La membrana di dialisi RC è incorporata nell’adesivo NOA 81 e non è richiesta ulteriore manipolazione o bloccaggio meccanico. 4. Connettori fluidici NOTA: Il design del chip microfluidico è costituito da un canale fluidico lineare per la soluzione di cristallizzazione e da un serbatoio centrale per il campione proteico (serbatoio proteico), entrambi mostrati da una vista dall’alto di due microchip nella figura 2A. Una membrana di dialisi RC è incorporata tra queste due microstrutture (Figura 2D) e il processo di cristallizzazione si evolve mentre i precipitanti dalla soluzione di cristallizzazione si diffondono attraverso la membrana a causa di un gradiente di concentrazione tra i due compartimenti del chip separati dalla membrana. Il canale microfluidico è impresso sullo stampo PDMS inferiore (Figura 1F). Una volta completato il protocollo di fabbricazione dei trucioli, il canale lineare si trova sullo strato inferiore dell’adesivo NOA 81 a contatto con il substrato PMMA, come mostrato nella figura 1K. Un ingresso e un punto di accesso di uscita per la soluzione di cristallizzazione si trovano ad ogni estremità del canale lineare e sembrano fori (altezza totale 90 μm) come si può vedere nella figura 2A. Per la gestione della soluzione di cristallizzazione, i connettori devono essere aggiunti sui punti di accesso. Connettori bond disponibili in commercio (NanoPort) sull’ingresso e l’uscita del canale microfluidico con colla epossidica veloce (Figura 2C). Scegliere il diametro appropriato dei tubi PTFE in base alle dimensioni dei connettori. I tubi PTFE saranno utilizzati per l’introduzione della soluzione di cristallizzazione nel canale fluidico del chip.NOTA: I kit disponibili in commercio sono consigliati per un controllo facile e preciso della portata e di solito sono combinati con sistemi automatizzati azionati a pressione o controllati dal flusso (pompe per siringhe) per la miscelazione e la movimentazione dei fluidi. Tuttavia, la soluzione di cristallizzazione può essere introdotta manualmente nel canale lineare con una siringa di plastica usa e getta. In questo caso, vengono suggeriti i passaggi da 4.3 a 4.5. Riempire una siringa monouso da 1 ml con la soluzione di cristallizzazione. Per i chip presentati in questo protocollo, 400 μL sono sufficienti per riempire l’intero canale fluidico. Tagliare due punte di pipetta in modo che il diametro della punta su un lato sia uguale al diametro interno del tubo PTFE che verrà utilizzato per la movimentazione della soluzione. Incollare le punte ritagliate sui punti di accesso del canale con colla epossidica veloce (Figura 2B). Collegare la siringa con le punte ritagliate con un pezzo di tubo PTFE delle dimensioni appropriate e introdurre la soluzione all’interno del canale spingendo costantemente lentamente lo stantuffo della siringa. 5. Incapsulamento proteico NOTA: Il modello del chip dedicato all’uso come serbatoio proteico rimane finora aperto all’atmosfera. Il seguente protocollo è proposto per confinare accuratamente il campione proteico all’interno del chip microfluidico. Pipettare manualmente una goccia del campione proteico all’interno del serbatoio proteico, situato proprio sulla membrana di dialisi RC, come illustrato nella figura 2E. Il volume del campione proteico varia a seconda del design del chip e può essere di 0,1 o 0,3 μL. Applicare un sottile strato di grasso siliconico ad alto vuoto intorno al serbatoio proteico. Tagliare un piccolo pezzo di un foglio PMMA spesso 175 μm e posizionarlo delicatamente sopra lo strato sottile del grasso siliconico. Il pezzo PMMA deve coprire l’intera superficie del serbatoio proteico in cui viene depositata la soluzione proteica.NOTA: Il grasso siliconico viene utilizzato per migliorare la tenuta all’aria e prevenire la diffusione della goccia proteica. Non c’è incollaggio o sigillatura tra il pezzo PMMA utilizzato per coprire il serbatoio proteico e l’adesivo NOA 81. Il contatto tra di loro è un’interfaccia solida/solida. Al fine di produrre una tenuta complessiva e un incapsulamento a tenuta d’aria del campione proteico, viene utilizzato un pezzo di nastro Kapton come descritto al passaggio 5.4.NOTA: A volte è difficile confinare il campione proteico all’interno della cavità dedicata del dispositivo (serbatoio proteico) quando viene utilizzato un sistema a pressione per l’introduzione della soluzione di cristallizzazione all’interno del canale fluido (fase 6.4). Per evitare il problema sopra menzionato, i valori di pressione relativamente bassi dovrebbero essere mantenuti durante la circolazione della soluzione di cristallizzazione. Si suggerisce una pressione di iniezione di 20-60 mbar per soluzioni acquose o 50-150 mbar per soluzioni più viscose (PEG, glicerolo)19. Tagliare un pezzo di nastro Kapton (20 μm di spessore) abbastanza grande da coprire il pezzo PMMA posto sopra il serbatoio proteico e attaccare sul chip NOA intorno a tutti i bordi. Il campione proteico è incapsulato all’interno del serbatoio e il chip è pronto per essere utilizzato per l’esperimento di cristallizzazione, come mostrato nella figura 2C.NOTA: I trucioli possono essere riutilizzati più volte fino a quando la membrana di dialisi e l’adesione di NOA sul substrato PMMA non si deteriorano. Se queste parti del chip sono danneggiate, si osservano perdite che verificano che il dispositivo non possa più essere utilizzato. Il lavaggio dei trucioli dipende dalla soluzione di cristallizzazione. Nel caso di soluzioni a bassa viscosità (sali, tamponi), il canale fluidico può essere lavato semplicemente introducendo acqua distillata e lasciarla scorrere per alcuni minuti. 400 μL è il volume necessario per scambiare completamente una soluzione all’interno del canale con un’altra soluzione. Nel caso di soluzioni più viscose (PEG, glicerolo), il riutilizzo dei trucioli non è raccomandato poiché il lavaggio del canale solo con acqua non è sufficiente. La parte superiore del chip, dove si trova il serbatoio proteico, può anche essere lavata con acqua distillata e asciugata con aria pressurizzata. 6. Cristallizzazione delle proteine su chip Pesare la polvere di lisozima di gallina liofilizzata e sciogliere in acqua distillata per ottenere una concentrazione finale di 30 mg di mL-1. Filtrare la soluzione proteica attraverso un filtro da 0,22 μm e centrifugare per 5 minuti alla massima velocità a 293 K per rimuovere tutte le particelle solide. Utilizzare il supernatante per l’esperimento di cristallizzazione. Preparare 500 μL di soluzione di cristallizzazione contenente il tampone e il precipitante in concentrazioni fornite nella tabella 1. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm. Iniettare la soluzione nel punto di ingresso del chip con una siringa o un sistema fluido automatizzato a pressione o una pompa per siringhe, come descritto nei passaggi 4.1-4.5.NOTA: L’esperimento di cristallizzazione può avvenire sia in condizioni statiche, se il canale microfluidico è riempito con la soluzione di cristallizzazione e messo da parte, sia in condizioni di flusso, se viene continuamente iniettato all’interno del canale a una portata costante. Per quest’ultimo caso, si raccomanda l’uso di un sistema esterno a pressione o di una pompa per siringhe. La realizzazione dell’esperimento in condizioni fluide offre anche la possibilità di scambiare dinamicamente soluzioni di cristallizzazione all’interno del canale fluidico. Pertanto, più esperimenti possono essere condotti durante l’utilizzo dello stesso campione proteico. Una volta riempito il canale fluidico con la soluzione di cristallizzazione, sigillare le porte di ingresso e uscita del chip con nastro parafilm. Pipettare il volume appropriato della soluzione proteica all’interno del serbatoio proteico e incapsulare il campione proteico come descritto nei passaggi 5.1-5.4. Conservare il chip a 293 K.NOTA: La cristallizzazione tramite dialisi segue una traiettoria cinetica diversa dagli esperimenti condotti con il metodo di diffusione del vapore o la cristallizzazione del lotto e dipende profondamente dalla natura delle molecole precipitanti coinvolte nel processo di diffusione, secondo i datimisurati 51, e potrebbe essere necessario più tempo per l’inizio della nucleazione. Al fine di prevenire l’evaporazione, se presente, durante questo periodo, posizionare il truciolo in un’atmosfera satura di umidità a 293 K. 7. Diffrazione a raggi X in situ e su chip Supporto stampato in 3D per travi Stampare il supporto in grado di trasportare fino a tre chip contemporaneamente. Le dimensioni del supporto sono le stesse delle dimensioni delle piastre di cristallizzazione commerciale (standard 96 well/SBS) compatibili con gli esperimenti di diffrazione a raggi X a piastre.NOTA: La stampa del supporto può essere assegnata a servizi commerciali. Il supporto è stato progettato utilizzando un software di progettazione 3D-CAD ed è mostrato nella figura 3A durante gli esperimenti di cristallizzazione delle proteine su chip e nella figura 3B durante la raccolta di dati di diffrazione a raggi X in situ a BM30A-FIP (ESRF). Stabilizzare i chip di dialisi sul supporto con un nastro mono o doppio lato. In situ Diffrazione dei raggi X Raccogli i dati di diffrazione dei raggi X a temperatura ambiente dai cristalli coltivati nel serbatoio proteico. Ad esempio, utilizzare raggi X con un’energia di 12.656 keV, un flusso di 3,32 x 1010 fotoni s-1 e una dimensione del fascio di 250 x 250 μm2. Registra le immagini di diffrazione con un rilevatore ADSC Quantum 315r con una matrice di CCD 3 x 3 per una superficie attiva di risoluzione di 315 x 315 mm2 e 9,4 mega pixel.NOTA: I dati di diffrazione per i cristalli di lisozima coltivati sui chip di dialisi sono stati raccolti presso la linea di fascio BM30A-FIP presso l’European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Tuttavia, la dimensione del fascio, il flusso e il tipo di rivelatore possono essere diversi in altre sorgenti di radiazioni a raggi X. Il supporto stampato in 3D consente la raccolta dei dati con un intervallo angolare da -40° a +40° intorno al cristallo. Il numero dei cristalli di lisozima esposti per la raccolta dei dati in situ, il numero dei modelli di diffrazione raccolti per ciascun cristallo, l’intervallo dell’angolo di oscillazione per esposizione e il tempo di esposizione sono riassunti nella tabella 2. Trattamento dei dati Elaborare i set di dati completi o parziali con i modelli di diffrazione per i cristalli di lysozima con il programma XDS48. Generare il file HKL per ogni set di dati e ridimensionarli utilizzando il software XSCALE48. Utilizzare la sostituzione molecolare con il programma Phaser della suiteCPP4 49 e determinare le fasi per la costruzione del modello. Per questo passaggio, utilizzare le coordinate 3D note del lisozima dalla voce 193L della Protein Data Bank (PDB). Perfezionare la struttura utilizzando Phenix52 e ispezionare il modello proteico finale utilizzando COOT50.

Representative Results

I chip microfluidici sviluppati da Junius etal. Le immagini dei microchip, il loro design dettagliato, i connettori fluidici e la membrana di dialisi RC sono illustrate nella figura 2. Gli esperimenti di cristallizzazione vengono impostati convogliando manualmente il campione proteico direttamente nel serbatoio proteico e introducendo la soluzione di cristallizzazione nel canale fluidico lineare con un sistema automatizzato azionato a pressione o pompa a siringa o manualmente con l’aiuto di una siringa. Il serbatoio proteico e il canale fluidico possono essere distinti nella figura 2A. I disegni per la fabbricazione di trucioli con un volume massimo di 0,1 μL o 0,3 μL del serbatoio proteico sono riportati rispettivamente nella figura 2A a sinistra e a destra. I trucioli con una capacità massima di 0,2 μL o 0,7 μL per il campione proteico sono indicati altrove19. Il punto culminante del protocollo per la fabbricazione del dispositivo può essere ristretto sull’uso della resina fotocurabile a base di tiolene NOA 81 incorporando membrane di dialisi RC disponibili in commercio di vari MWCO. Durante la fabbricazione dei dispositivi microfluidici, il canale fluidico lineare viene impresso sullo stampo PDMS inferiore (Figura 1F), mentre lo stampo PDMS superiore è costituito solo dai pilastri modellati per il serbatoio proteico e dalle porte di ingresso euscita (Figura 1F). Una volta che NOA 81 è collegato e gli stampi PDMS vengono rimossi dall’assieme (Figura 1K), il canale fluido si trova nello strato inferiore del microchip e il canale proteico e le porte di ingresso /uscita si trovano su entrambi gli strati. La figura 1L illustra uno schema di vista laterale del chip di dialisi in cui sono indicati tutti gli strati del dispositivo e il rispettivo spessore. L’altezza dei motivi impressi sullo strato inferiore dei trucioli (canale fluido) è di circa 45 μm, mentre l’altezza totale delle porte di ingresso e uscita è di circa 90 μm. Il serbatoio proteico (altezza 45 μm) è illustrato anche nelle figure 2D e 2E. L’allineamento dei due strati è stato studiato al microscopio ottico e il pezzo della membrana di dialisi RC incorporato all’interno del microchip può essere chiaramente distinto nella figura 2D. Nella stessa figura, l’aria è stata intrappolata all’interno del canale fluidico durante l’iniezione della soluzione di cristallizzazione, come si può vedere nella parte superiore sinistra del serbatoio proteico. La figura 2E è una fotografia ravvicinata del serbatoio proteico dopo la deposizione manuale della goccia proteica con una pipetta e prima dell’incapsulamento della goccia con un pezzo di nastro PMMA e Kapton, come descritto nei passaggi 5.2 e 5.3 del protocollo. Il chip microfluidico pronto per essere utilizzato per esperimenti di cristallizzazione, dopo l’incapsulamento del campione proteico e l’incollaggio dei connettori fluidici, è raffigurato nella figura 2C. L’assemblaggio ermetica assicura che non si verifichino perdite. I connettori fluidici per le porte di ingresso e di uscita del canale microfluidico possono essere quelli disponibili in commercio come descritto al passaggio 4.1 del protocollo e mostrato nella figura 2C,oppure le punte di pipetta da laboratorio usa e getta possono essere utilizzate per lo stesso scopo(Figura 2B, fase del protocollo 4.4). Per la fabbricazione dei chip microfluidici sono stati scelti materiali otticamente trasparenti e biologicamente inerti, dimostrando un’elevata compatibilità per gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente. Le interazioni dei raggi X, dell’assorbimento e dello scattering, con i materiali che compongono il dispositivo microfluidico e l’atmosfera circostante (aria) generano un segnale noto come rumore di fondo. Questo rumore riassume il segnale di diffrazione dei cristalli proteici registrati dal rivelatore, decadendo il rapporto segnale-rumore e deve essere mantenuto il più basso possibile durante la raccolta dei dati di diffrazione a raggi X. Abbiamo valutato il rumore di fondo generato dai materiali che compongono il serbatoio proteico, che si trova nel percorso diretto del fascio di raggi X. Il serbatoio proteico è costituito dalla membrana di dialisi RC, dal nastro Kapton e da due pezzi pmma, uno utilizzato come substrato per il microchip e uno utilizzato per l’incapsulamento del campione proteico. Lo spessore del PMMA è di 2 x 175 μm, del nastro Kapton 20 μm, e la membrana di dialisi RC è spessa circa 40 μm(Figura 1L). Lo spessore totale di questi strati è di circa 410 μm e lo strato NOA 81 non è nel percorso diretto a raggi X. Oltre allo spessore dei materiali di fabbricazione, la loro densità è cruciale anche per misurare il rumore di dispersione dello sfondo, poiché lo scattering a raggi X aumenta con il numero atomico elementale. Per questo motivo, il flusso di elio (una caratteristica fornita al BM30A-FIP all’ESRF) è stato utilizzato al posto dell’aria durante la raccolta dei dati per la caratterizzazione dei materiali e per gli esperimenti di diffrazione proteica. La figura 3C illustra il rumore di fondo generato dal nastro Kapton, dalla membrana di dialisi RC, dal foglio PMMA e dal loro assemblaggio in atmosfera elio. Ogni materiale è stato esposto per 20 s ai raggi X di lunghezza d’onda 0,98 Å e la distanza del rivelatore di campioni era di 200 mm. Gli esperimenti sono stati eseguiti sulla linea di fascio BM30A-FIP all’ESRF, come spiegato nella fase 7 del protocollo. Gli anelli diffusi attribuiti alle interazioni del fascio di raggi X con i materiali possono essere distinti per il nastro Kapton con una risoluzione inferiore a 4 Å, il foglio PMMA tra 4-8 Å e la membrana di dialisi tra la risoluzione 4-5 Å. Il rumore di fondo generato dal chip di dialisi si osserva principalmente a una risoluzione inferiore a 6 Å che non influisce sul trattamento dei dati di diffrazione ad alta risoluzione dei grandi cristalli di lisozima. L’intensità di dispersione dello sfondo in funzione della risoluzione per il microchip e i materiali separati sono mostrati altrove19. Nella misurazione presentata nella figura 3C, il chip di dialisi era vuoto di qualsiasi soluzione (proteina o soluzione precipitante) e il contributo della presenza di soluzione al rumore di fondo non è stato misurato. I chip sono stati montati davanti al fascio di raggi X con un supporto stampato in 3D (Figura 3B) progettato per esperimenti di diffrazione in situ 19. Tuttavia, lo stesso supporto con dimensioni uguali alle dimensioni di una piastra di cristallizzazione standard 96-well/SBS, può essere utilizzato per eseguire da 1 a 3 esperimenti di cristallizzazione contemporaneamente, in quanto può contenere fino a 3 chip contemporaneamente (Figura 3A). Sono stati condotti esperimenti per valutare l’efficienza dei dispositivi microfluidici per la cristallizzazione su chip di proteine solubili modello con il metodo della microdialisi. Il canale fluido è stato riempito come descritto nella fase 4 del protocollo, mentre i passaggi 5 e 6 hanno descritto come incapsulare il campione proteico all’interno del serbatoio proteico dedicato e come impostare gli esperimenti di cristallizzazione. La figura 4 mostra cristalli di lisozima coltivati a 293 K sotto 1,5 M di cloruro di sodio (NaCl) con acetato di sodio 0,1 M (CH3COONa) pH 4,0 (A) e meno di 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4,5 con 30% di glicole polietilene (PEG) 400 (B). La polvere di gliozima lyofilizzata è stata sciolta in acqua ad una concentrazione finale di ~30 mg di mL-1 o in 20 mM CH3COONa pH 4.2 tampone ad una concentrazione finale di ~20 mg di mL-1 per gli esperimenti illustrati rispettivamente nelle figure 4A e 4B. Il volume del campione proteico in entrambi gli esperimenti è stato di circa 0,3 μL e il MWCO della membrana di dialisi RC incorporata all’interno dei microchip si trova nell’intervallo di 6-8 kDa. I cristalli di lysozima mostrati nella figura 3A sono cresciuti di 1 h e i cristalli della figura 3B sono cresciuti entro 30 minuti dall’inizio dell’esperimento. Gli esperimenti di cristallizzazione sono stati effettuati in condizioni statiche. Tuttavia, è stato dimostrato19 che condurre gli esperimenti in condizioni fluide offre la possibilità di scambiare dinamicamente le condizioni di cristallizzazione e i diagrammi di fase di studio, verificando la reversibilità del metodo della microdialisi. In situ I dati di diffrazione a raggi X dei cristalli di lysozima mostrati nella figura 4A sono stati raccolti per dimostrare l’idoneità dei chip di dialisi per tali esperimenti. La raccolta dei dati è stata effettuata a BM30A-FIP beamline (ESRF) a temperatura ambiente, come descritto al passaggio 7.2.1 del protocollo. I microchip sono stati montati sulla linea di fascio con l’aiuto del supporto stampato in 3D(figura 3B)e i set completi di dati di diffrazione a raggi X sono stati raccolti da due singoli cristalli di lysozima coltivati su chip alle condizioni fornite nella seconda riga della tabella 1. Le riflessioni osservate dei set di dati sono state elaborate, indicizzate e integrate utilizzando XDS48 e la sostituzione e il perfezionamento molecolare sono stati realizzati utilizzando rispettivamente Phaser49 e Phenix52. Le statistiche cristallografiche per il set di dati completo di ciascun cristallo di lysozima e per la fusione dei due insiemi di dati sono fornite nella tabella 2. Per la sostituzione molecolare, è stato utilizzato l’ingresso PDB 193L. Le mappe a densità elettronica da un singolo cristallo di glisozima e il set di dati unito dei due cristalli sono state ottenute rispettivamente a 1,95 Å e 1,85 Å e sono illustrate nelle figure 5A e 5B. Entrambe le mappe di densità elettronica mostrano informazioni strutturali dettagliate che possono essere ottenute da esperimenti di diffrazione a raggi X in situ condotti direttamente sul microchip di dialisi a temperatura ambiente da un singolo cristallo o da più cristalli, rendendo i chip compatibili per studi di cristallografia a raggi X in situ. Figura 1: Illustrazione schematica della fabbricazione del chip di dialisi. (A) La resina SU-8 è depositata su due wafer di silicio e rivestita di spin. (B) Un master SU-8 viene acquisito dopo aver irradiato il fotoresist con luce UV attraverso una maschera fotografica e aver sviluppato le parti non esposite. (C) Il PDMS viene erogato sui master SU-8 e dopo essere stato stagionato a 338 K per 1 h,(D)i 2 stampi PDMS prodotti mediante stampaggio replica e imprinting i micro-pattern vengono sbucciati dei mastere (E)tagliati alle dimensioni appropriate. (F) Gli stampi PDMS sono supportati su uno scivolo di vetro che incorpora la membrana di dialisi RC tra i due pilastri centrali. (G) I 2 stampi PDMS vengono quindi allineati e essiccati per ~ 30 minuti in una camera a vuoto. (H) La resina NOA 81 viene versata tra i due stampi e (I) riempie lo spazio per capillarità. (J) Dopo la prima esposizione alla luce UV, lo stampo PDMS inferiore viene rimosso e l’assieme viene depositato su un foglio PMMA. (K) Segue la seconda esposizione ai raggi UV per polimerizzare completamente la resina NOA 81 e il chip di dialisi è pronto all’uso dopo aver rimosso lo stampo PDMS superiore rimanente. (L) Schema di visualizzazione laterale del chip di dialisi in cui sono indicati tutti gli strati del dispositivo e il rispettivo spessore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Trucioli di dialisi che incorporano una membrana di dialisi RC per la cristallizzazione delle proteine su chip e esperimenti di diffrazione a raggi X in situ. (A) NOA 81 microchip su substrato PMMA spesso 175 μm con un serbatoio proteico di 0,1 μL (a sinistra) e 0,3 μL (a destra) volume nominale. (B) Microchip con punte di pipetta come connettori fluidici incollati sulle porte di ingresso e di uscita del canale fluido. (C) Immagine di un microchip durante un esperimento di cristallizzazione. Il campione proteico è incapsulato con un pezzo di foglio PMMA spesso 175 μm e nastro Kapton. I connettori Peek Nanoport vengono utilizzati per le porte di ingresso e uscita del canale fluido. (D) Vista dall’alto del serbatoio proteico durante la circolazione della soluzione di cristallizzazione all’interno del canale fluidico. L’aria è intrappolata nella parte superiore del serbatoio proprio sotto la membrana di dialisi RC, che può essere chiaramente rilevata. (E) Vista dall’alto del serbatoio di dialisi attraverso un microscopio ottico durante la deposizione del campione proteico. La goccia proteica si deposita proprio sopra la membrana di dialisi RC incorporata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Supporto stampato in3D (A) per i microchip utilizzati durante gli esperimenti di cristallizzazione e (B) montato davanti al fascio di raggi X alla linea di fascio BM30A-FIP all’ESRF per esperimenti di diffrazione a raggi X in situ. (C) Rumore di fondo generato dall’interazione dei raggi X con Kapton, membrana di dialisi RC, PMMA e chip di dialisi (da sinistra a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Cristallizzazione su chip del glisozima con il metodo della microdialisi. (A) Lisozima (~30 mg di mL-1) cristalli coltivati su chip sotto 1,5 M NaCl e 0,1 M CH3COONa pH 4.0 e (B) lisozima (~20 mg mL-1)cristallizzati in condizioni di cristallizzazione contenenti 1 M NaCl, 0,1 M CH3COONa pH 4.5, e 30% PEG 400. Entrambi gli esperimenti sono stati condotti a 293 K. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Mappe a densità elettronica della raffinata struttura del glisozima da (A) un singolo cristallo e (B) il set di dati unito di due cristalli coltivati su chip tramite microdialisi. Le mappe sono state ottenute rispettivamente a 1,95 Å e 1,84 Å, sagomato a 1σ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. proteina Concentrazione proteica(mg di mL-1) Bufffer proteico Concentrazione iniziale diprecipitante soluzione MWCO di RCmembrana dialisi(kDa) temperaturaSignor Presidente, signor Presidente, signor Presidente, signor Presidente lisozima ~ 30 anni Acqua 1,5 M NaCl0,1 M CH3COONa pH 4.0 6 – 8 293 lisozima ~ 20 anni 20 mM CH3COONa pH 4.2 1 M NaCl0,1 M CH3COONa pH 4.530% PEG 400 6 – 8 293 Tabella 1: Composizione del tampone proteico e soluzione precipitante per la cristallizzazione su chip del glisozima con il metodo della microdialisi. I cristalli di lisozima coltivati su chip con le condizioni fornite nella seconda linea sono stati utilizzati per la raccolta di dati di diffrazione a raggi X in situ. proteina lisozima lisozima lisozima Numero di cristalli 1 1 2 Numero di fotogrammi di diffrazione 40 30 70 Oscillazione (°) per esposizione 1 1 Tempo di esposizione (s) 30 30 Temperatura (K) 293 293 293 Gruppo spaziale P43212 P43212 P43212 Parametri delle celle unitarie 78.86 78.86 37.8790.0 90.0 90.0 79.17 79.17 37.9590.0 90.0 90.0 78.47 78.47 37.6590.0 90.0 90.0 Intervallo di risoluzione (Å) 27.31 – 1.95(2.02 – 1.95) 27.39 – 1.96(2.03 – 1.96) 27.17 – 1.85(1.91 – 1.85) Mosaicità (°) 0.319 0.121 Riflessioni totali (osservate) 25127 (3552) 19991 (3001) Riflessioni uniche (osservate) 8641 (1357) 8295 (1321) 10404 (975) Redudancy 2.90 (2.61) 2.41 (2.27) Completezza (%) 95.0 (94.8) 91.9 (93.3) 98.23 (93.15) Mean I/σ 6.83 (1.16) 7.09 (1.66) 3.7 CC(1/2) 99.1 (42.4) 97.9 (37.0) 97.0 R-unione 0.184 R-mea 0.139 0.221 0.219 R-pim 0.116 Riflessioni utilizzate nella raffinatezza 8645 (787) 8451 (857) 10391 (965) Riflessioni utilizzate per l’r-free 864 (78) 846 (85) 1039 (96) R-lavoro 0.1988 (0.2968) 0.1853 (0.2872) 0.1839 (0.3102) Senza R 0.2430 (0.3437) 0.2297 (0.3622) 0.2207 (0.3703) Numero di atomi non idrogeno 1069 1071 1096 Macromolecole 1012 1012 1012 Acqua 55 57 82 ligando 2 2 2 Residui proteici 131 131 131 Rms (obbligazioni, Å) 0.008 0.009 0.005 Rms (angoli, °) 1.17 1.26 1.05 Ramachandran favorito (%) 98.43 97.64 99.21 Ramachandran consentito (%) 1.57 2.36 0.79 Valori anomali di Ramachandran (%) 0.00 0.00 0.00 Fattore B di Avegare 34.26 28.54 24.34 proteina 33.94 28.14 23.62 Acqua 40.23 35.57 33.16 Ligandi 33.23 29.63 24.77 Tabella 2: Parametri di raccolta dei dati, statistiche cristallografiche e di perfezionamento dei cristalli di glisozima coltivati su chip attraverso il metodo della microdialisi. I valori forniti tra parentesi corrispondono alla shell a risoluzione più alta. La quarta colonna corrisponde ai valori ottenuti dopo l’unione dei set di dati della seconda e della terza colonna.

Discussion

È stato sviluppato un dispositivo microfluidico per la cristallizzazione delle proteine su chip con il metodo della microdialisi e gli esperimenti di diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente. È possibile fabbricare chip NOA 81 che integrano membrane di dialisi RC di qualsiasi MWCO al fine di utilizzare la microdialisi per la cristallizzazione delle proteine su chip. Sono stati utilizzati materiali di fabbricazione con una trasparenza dei raggi X relativamente elevata, rendendo i chip compatibili per la cristallografia proteica in situ. I materiali di fabbricazione che compongono il compartimento per la cristallizzazione proteica del dispositivo (PMMA, Kapton, membrana di dialisi RC) sono stati valutati per generare un basso rumore di fondo. In particolare, il rumore di fondo generato dal chip di dialisi è osservato principalmente a bassa risoluzione (> 6 Å) e non influisce sul trattamento dei dati di diffrazione ad alta risoluzione dei grandi cristalli di lisozima necessari per la determinazione della struttura proteica. L’automazione della raccolta dei dati viene amplificata utilizzando un supporto stampato in 3D che può essere montato direttamente in travi di cristallografia macromolecolare e trasportare fino a tre microchip contemporaneamente. In questo modo, si evita la raccolta manuale e la manipolazione dei fragili cristalli proteici. Inoltre, la raccolta dei dati avviene a temperatura ambiente, evitando la necessità di crioprotezione che può essere correlata a cambiamenti conformazionali dalla struttura proteicanativa 2,3.

L’uso della microdialisi come metodo per far crescere i cristalli su chip consente di monitorare e controllare con precisione il processo di cristallizzazione. Come discusso nell’introduzione, la maggior parte dei metodi convenzionali di cristallizzazione delle proteine sono stati implementati utilizzando dispositivi microfluidici11,14. Tuttavia, i vantaggi della dialisi per la cristallizzazione delle proteine non erano ancora stati pienamente sfruttati su scala micrometrica. La microdialisi su chip offre la possibilità di studiare diagrammi di fase ed eseguire lo screening e l’ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione con lo stesso campioneproteico 19. Per i prototipi presentati in questo lavoro, il consumo proteico per chip è limitato a 0,1 o 0,3 μL. Sulla base del lavoro sperimentale finora svolto, le fasi più critiche del protocollo non derivano dalla procedura di fabbricazione dei chip ma dal processo di cristallizzazione. Il protocollo di fabbricazione include molti passaggi, ma è semplice e consente la fabbricazione di numerosi dispositivi (da 20 a 30 chip) in un solo giorno nella camera pulita, con materiali relativamente economici. Tuttavia, la cristallizzazione su chip delle proteine può essere una procedura delicata a causa della natura stocastica intrinseca della nucleazione e della crescita cristallina, specialmente nella microscala. È stato descritto un caso di studio, in cui sono state utilizzate condizioni ben consolidate per la cristallizzazione del lisozima che ha prodotto cristalli robusti e ben definiti adatti per la raccolta di dati di diffrazione a raggi X in situ. Tuttavia, possono sorgere difficoltà dall’uso di obiettivi proteici più impegnativi, come le proteine di membrana, dove il mezzo di cristallizzazione è molto più complicato, i diagrammi di fase non sono noti e le condizioni di cristallizzazione ben funzionanti non sono ancora ben consolidate. Il chip di dialisi offre la possibilità di superare queste difficoltà e studiare diagrammi di fase su chip, senza smaltire il prezioso e spesso costoso campione proteico, semplicemente scambiando la soluzione di cristallizzazione all’interno del canale microfluidico.

La versatilità dei dispositivi microfluidici deriva dallo sfruttamento della microdialisi per la cristallizzazione delle proteine su chip al fine di controllare reversibilmente le condizioni di cristallizzazione e mappare la concentrazione e la temperatura vari diagrammi di fase utilizzando un basso volume proteico. Inoltre, il dispositivo è compatibile con esperimenti di diffrazione a raggi X in situ e la prototipazione dei dispositivi è economica e rapida. Numerosi cristalli isomorfi di proteine solubili e di membrana (in preparazione) possono essere coltivati su chip e si prevede che tutte queste caratteristiche possano essere utilizzate per studi di cristallografia seriale a raggi X di obiettivi proteici impegnativi presso impianti di sincrotrone e XFEL. Infine, l’esecuzione di studi su chip e in situ risolti nel tempo è una possibilità futura che potrebbe essere di notevole interesse per la comunità cristallografica. Pertanto, coltivando cristalli sul chip di dialisi e introducendo i reagenti nel canale microfluidico, manualmente (usando una siringa) o automaticamente (con un sistema fluido di controllo della pressione o una pompa a siringa), gli sforzi futuri si concentreranno sulla dimostrazione che i chip microfluidici possono essere utilizzati con successo per innescare esperimenti risolti nel tempo sulle linee di fascio di sincrotrone.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MBS riconosce il supporto dell’MI/CNRS nell’ambito del contratto Instrumentation ai limiti 2014-2015. NJ riconosce il Programma internazionale di ricerca di dottorato (Irtelis) del CEA per la Borsa di dottorato. MBS e SJ riconoscono i finanziamenti del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione europea nell’ambito della sovvenzione Marie Skłodowska-Curie numero 722687. MBS, SJ e NJ ringraziano LIPhy (UGA) per lo stabilimento della camera pulita per gli esperimenti di microfabbricazione. IBS riconosce l’integrazione nell’Istituto di Ricerca Interdisciplinare di Grenoble (IRIG, CEA).

Materials

3 in wafer Silicon Materials Inc. Silicon wafer
Centrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
CleWin 3.0 WieWeb software Designing software
Epoxy glue Devcon 5 minutes epoxy glue
Fluidic connectors Cluzeau Info Lab N-333 NanoPort kit for 1/16" OD tubing
Hen egg-white lysozyme Roche 10 837 059 001 Lyophilized protein powder
High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554 Dow Corning high-vacuum silicone grease
HMDS Sigma-Aldrich 440191 Silane, chemical
Hot plate Sawatec HP-200-Z-HMDS BM Hot plate
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich Solvent
Kapton tape DuPont Polyimide tape
Mask aligner SUSS MicroTec MJB4 Mask aligner, UV source
Membrane filter Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
Microscope glass slide Fisher Scientific 12164682 3 x 1 in glass slides
NOA81 Norland Products Inc.  NOA81 Photocurable resin
Oven Memmert Oven
Parafilm Sigma-Aldrich P6543 Parafilm M roll size 20 in. × 50 ft
PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone
PEG 400 Hampton Research HR2-603 Chemical
Petri dish Sigma-Aldrich P5731 100 x 15 mm
PGMEA Sigma-Aldrich 484431 Developer
Plasma equipment Diener Electronic ZEPTO Plasma treatment
PMMA Goodfellow 137-745-63 PMMA sheets 150×150 mm, 0.175 mm thickness
Pressure driven system Elveflow OB1 MK3+ Pressure/vacuum controller
PTFE tubing Elveflow/Darwin microfluidics LVF-KTU-15 PTFE tubing roll 1/16" OD X 1/32" ID
RC dialysis membrane Spectra/Por Various MWCOs
Scalpel Swann-Morton Carbon steel surgical blades
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Solidworks Dassault Systemes 3D-CAD designing software
Spin coater SPS Spin150 Wafer spinner
SU-8 3000 series MicroChem Corp. SU-8 3050 Photoresist
Syringe BD 309628 1 mL Luer-Lok syringe
UV crosslinker Uvitec CL-508 UV crosslinker
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References

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Jaho, S., Junius, N., Borel, F., Sallaz-Damaz, Y., Salmon, J., Budayova-Spano, M. Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies. J. Vis. Exp. (170), e61660, doi:10.3791/61660 (2021).
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