Успешная визуализация кальция In vivo с миниатюрным микроскопом Head-Mount в миндале свободно ведя себя мышью
Summary
Микроэндоскопическая визуализация кальция In vivo является бесценным инструментом, позволяющим в режиме реального времени контролировать нейронную активность у свободно ведя себя животных. Однако применение этого метода к миндалинам было трудно. Этот протокол призван обеспечить полезное руководство для успешного ориентации клеток миндалины с миниатюрным микроскопом у мышей.
Abstract
In vivo в режиме реального времени мониторинга нейронной деятельности в свободно движущихся животных является одним из ключевых подходов к увязки нейронной активности с поведением. Для этого разработана и успешно применена технология визуализации in vivo, которая обнаруживает переходный кальций в нейронах с использованием генетически закодированных показателей кальция (GECIs), миниатюрный флуоресцентный микроскоп и градиентный рефракционный индекс (GRIN) объектив1,2,3,4,5,6. Этот метод визуализации является особенно мощным, поскольку он позволяет хронической одновременной визуализации генетически определенных популяций клеток в течение длительного периода до нескольких недель. Хотя это полезно, этот метод визуализации не был легко применен к структурам мозга, которые находят глубоко в головном мозге, таких как миндалина, существенная структура мозга для эмоциональной обработки и ассоциативнойпамяти страха 7. Есть несколько факторов, которые делают его трудно применить технику визуализации миндалины. Например, артефакты движения обычно встречаются чаще во время визуализации, проводимой в более глубоких областях мозга, потому что микроскоп, имплантированный глубоко в мозг, относительно нестабилен. Другая проблема заключается в том, что боковой желудочек расположен близко к имплантированному объективу GRIN, и его движение во время дыхания может вызвать крайне нерегулярные артефакты движения, которые не могут быть легко исправлены, что затрудняет формирование стабильного изображения. Кроме того, поскольку клетки миндалины, как правило, тихие в состоянии покоя или анестезии, трудно найти и сфокусировать целевые клетки, выражаюющие GECI в миндалинах во время процедуры основания для более поздней визуализации. Этот протокол обеспечивает полезное руководство о том, как эффективно целевых клеток, выражаюющих GECI в миндалинах с головой монтажа миниатюрный микроскоп для успешного in vivo кальция изображения в такой глубокой области мозга. Отмечается, что данный протокол основан на конкретной системе (например, Inscopix), но не ограничивается ею.
Introduction
Кальций является вездесущим второй посланник, играя решающую роль почти в каждой клеточнойфункции 8. В нейронах, потенциал действия стрельбы и синаптических входных вызвать быстрое изменение внутриклеточного свободного “Ca2″9,10. Таким образом, отслеживание преходящих кальция дает возможность контролировать активность нейронов. GECIs являются мощными инструментами, которые позволяют для мониторинга«Ca 2»в определенных популяциях клеток ивнутриклеточных отсеков 11,12. Среди многих различных типов белка на основе кальция индикатор, GCaMP, Ca2 “зонд на основе одной молекулы GFP13, является наиболее оптимизированным и, таким образом, широко используется GECI. Благодаря нескольким инженерным раундам, ряд вариантов GCaMP былразработан 12,14,15,16. Мы используем один из недавно разработанных GCaMPs, GCaMP7b, в этом протоколе16. Датчики GCaMP в значительной степени способствовали изучению функций нейронных цепей в ряде модельныхорганизмов, таких как визуализация переходных элементов Ca 2 во время развития17, виво изображения в определенном корковомслое 18, измерение динамики цепи вдвигательной задаче обучения 19 и визуализации активности клеточного ансамбля,связанные с ассоциативной памятью страхав гиппокампе и миндалинах 20,21.
Оптическая визуализация GECIs имеет ряд преимуществ22. Генетическое кодирование позволяет ГЕКИ быть четко выражены в течение длительного периода времени в определенном подмножестве клеток, которые определяются генетическим профилем или конкретными моделями анатомических связей. Оптическая визуализация позволяет in vivo хронический одновременный мониторинг сотен и тысяч нейронов у живых животных. Несколько оптических систем визуализации были разработаны для in vivo изображения и анализа GECIs в головном мозге свободно ведет себя мышей с головой монтаж миниатюрныхфлуоресцентных микроскопов 21,23,24,25. Несмотря на метод оптической визуализации in vivo, основанный на GECIs, объектив GRIN и миниатюрный микроскоп, установленный на голове, является мощным инструментом для изучения связи между активностью нейронной цепи и поведением, применение этой технологии к миндалинам было трудно из-за нескольких технических проблем, связанных с таргетингом объектива GRIN на клетки, выражаюющие ГЕКИ в миндалинах, не вызывая эффектных артефактов, которые серьезно снижают качество изображения и находят клетки, выражают Этот протокол призван обеспечить полезное руководство для хирургических процедур вложения базовой пластины и имплантации объектива GRIN, которые являются важнейшими шагами для успешного виво оптической визуализации кальция в миндалинах. Хотя этот протокол нацелен на миндалины, большинство процедур, описанных здесь, как правило, применимы к другим более глубоким областям мозга. Хотя этот протокол основан на определенной системе (например, Inscopix), та же цель может быть легко достигнута с другими альтернативными системами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Умелые методы хирургии имеют важное значение для достижения успешного виво оптической визуализации кальция с головой монтажа миниатюрной микроскопии в более глубоких областях мозга, таких как миндалина, как мы описали здесь. Поэтому, хотя этот протокол является ориентиром для оптими?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Научно-технологического фонда Samsung (Проект номер SSTF-BA1801-10).
Materials
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
References
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
